品种与饲养系统对牛奶生物活性抗炎特性的影响

Breed and Feeding System Impact the Bioactive Anti-Inflammatory Properties of Bovine Milk.

作者信息Angela Salzano, Maria Chiara Di Meo, Nunzia D'Onofrio, Giovanna Bifulco, Alessio Cotticelli, Francesca Licitra, Antonio Iraci Fuintino, Giuseppe Cascone, Maria Luisa Balestrieri, Ettore Varricchio, Giuseppe Campanile
PMID36232386
发布时间2022-09-21
DOI10.3390/ijms231911088

实验完整度

研究包含两个独立实验设计(品种对比、饲养系统对比),涉及牛奶及乳制品成分分析和多种细胞实验(细胞活力、炎症、氧化应激、凋亡、自噬等)等多个证据层级。

主要模型

牛群(荷斯坦牛与莫迪卡纳牛) 人主动脉内皮细胞(TeloHAEC细胞系)

重点核对

牛奶和乳制品中甜菜碱和肉碱含量 抗氧化活性(TAC和FRAP) IL-6诱导内皮细胞炎症模型 细胞预处理条件(16小时,20% v/v牛奶)

摘要

本研究旨在评估品种和饲养系统对牛奶奶油碱和肉碱谱的影响,以及牛奶抵抗白细胞介素(IL)-6诱导的内皮细胞(EC)炎症损伤的能力。在第一个实验设计中,选择了两个品种(荷斯坦牛与莫迪卡纳牛)来研究牛奶和乳制品中的生物分子含量和抗氧化能力。在第二个实验设计中,仅在荷斯坦牛中测试了两种饲养系统(放牧vs.全混合日粮),以评估其对牛奶和乳制品功能特性的可能影响。最后,使用两个实验设计的混合牛奶来评估其预防IL-6诱导的内皮炎症损伤的功效。结果表明,与荷斯坦牛奶相比,莫迪卡纳牛奶和乳清具有更高的生物分子含量和抗氧化活性(p < 0.01)。与放牧荷斯坦牛奶相比,饲喂TMR的荷斯坦牛奶中γ-丁酰甜菜碱、δ-戊甜菜碱(p < 0.01)和左旋肉碱(p < 0.05)浓度更高。同样,饲喂TMR的荷斯坦乳清中δ-戊甜菜碱、甘氨酸甜菜碱、左旋肉碱和乙酰左旋肉碱含量也更高(p < 0.01)。相反,牛奶和乳制品的抗氧化活性不受饲养系统的影响。在内皮细胞中,所有牛奶样本均减少了IL-6诱导的细胞因子释放、活性氧(ROS)积累和细胞死亡诱导,其中莫迪卡纳牛奶的效果最强(p < 0.01)。总体而言,与荷斯坦牛奶相比,莫迪卡纳牛奶具有更高的生物分子含量和抗氧化活性,表明品种比饲养系统更能积极影响奶牛牛奶的健康促进作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
品种和饲养系统是否影响牛奶及乳制品中生物活性成分含量、抗氧化活性和抗炎特性?
核心机制
莫迪卡纳牛奶中的甜菜碱和肉碱类生物活性成分通过其抗氧化活性减轻氧化应激,从而抑制IL-6诱导的内皮细胞炎症、凋亡和自噬。
主要证据
莫迪卡纳牛奶和乳制品中甜菜碱和肉碱含量更高,抗氧化活性(TAC和FRAP)更强;在体外内皮细胞模型中,莫迪卡纳牛奶显著抑制IL-6诱导的细胞因子释放、ROS产生和细胞死亡。
研究意义
该研究表明品种比饲养系统更能影响牛奶的健康促进作用,支持通过选育和饲养管理提升乳制品的功能性,并有助于保护莫迪卡纳等本土品种。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

品种对牛奶及乳制品生物分子和抗氧化活性的影响

评估荷斯坦牛和莫迪卡纳牛品种对牛奶和乳制品中甜菜碱、肉碱含量及抗氧化活性的影响

两个品种各选取30头奶牛,采集牛奶、乳清、乳清干酪和莫扎里拉奶酪样品,测定生物标志物含量和抗氧化活性(TAC、FRAP)。

2

饲养系统对荷斯坦牛奶和乳制品生物分子和抗氧化活性的影响

评估全混合日粮(TMR)与放牧两种饲养系统对荷斯坦牛奶和乳制品中生物分子含量和抗氧化活性的影响

两组荷斯坦牛分别饲喂TMR和放牧,收集牛奶及乳制品样品,测定生物标志物和抗氧化活性。

3

牛奶提取物对内皮细胞活力的影响

评估不同品种和饲养系统的牛奶提取物对内皮细胞活力的影响,以及其对IL-6诱导的细胞活力下降的保护作用

将不同浓度的牛奶提取物(0-20% v/v)作用于内皮细胞(TeloHAEC),检测细胞活力;随后用IL-6(20 ng/mL)刺激,检测牛奶预处理(16小时,20% v/v)的保护作用。

4

牛奶提取物对IL-6诱导的炎症反应的影响

评估牛奶提取物对IL-6诱导的内皮细胞炎症因子和NO释放的影响

用牛奶提取物预处理内皮细胞后,用IL-6刺激,检测细胞因子(IL-18、IL-1β、TNF-α)和NO的释放水平。

5

牛奶提取物对IL-6诱导的氧化应激的影响

评估牛奶提取物对IL-6诱导的内皮细胞线粒体和细胞外ROS产生的影响

用牛奶提取物预处理后,IL-6刺激,检测线粒体ROS和细胞外ROS水平。

6

牛奶提取物对IL-6诱导的细胞凋亡和自噬的影响

评估牛奶提取物对IL-6诱导的内皮细胞凋亡和自噬的影响

用牛奶提取物预处理后,IL-6刺激,检测凋亡和自噬相关蛋白表达和细胞染色。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Amicon Ultra 0.5 mL离心过滤器Millipore--
Precellys 24系统Bertin Technologies--
安捷伦LC-MSD SL四极杆离子阱质谱Agilent--
总抗氧化能力检测试剂盒Abcamab65329
铁离子还原抗氧化能力检测试剂盒Sigma AldrichMAK369
TeloHAEC细胞系ATCCCRL-4052
血管细胞基础培养基ATCCPCS-100-030
内皮细胞生长试剂盒-VEGFATCCPCS-100-041
细胞计数试剂盒-8Donjindo Molecular Technologies--
人白细胞介素-18 ELISA试剂盒BioVendorRAF143R
人IL-1β定量ELISA试剂盒R&D SystemsDLB50
ELISA Cymax TNF-α ELISA试剂盒AbFrontierYIF-LF-EK0193
一氧化氮检测试剂盒Abcamab65328
MitoSOX Red线粒体超氧化物指示剂InvitrogenM36008
Amplex Red过氧化氢/过氧化物酶检测试剂盒InvitrogenA22188
甲萘醌Sigma AldrichM57405
FITC Annexin V凋亡检测试剂盒BD Pharmigen556547
自噬检测试剂盒Abcamab139484
抗肿瘤坏死因子α抗体Abcamab6671
抗白细胞介素1β抗体Abcamab216995
抗白细胞介素18抗体Abcamab243091
抗自噬相关蛋白5抗体Cell Signaling Technology9980
抗SQSTM1/p62抗体Cell Signaling Technology5114
抗半胱天冬酶3抗体Cell Signaling Technology9662
抗半胱天冬酶9抗体Cell Signaling Technology9508
抗多聚ADP核糖聚合酶抗体Abcamab194586
抗α-微管蛋白抗体Elabscience BiotechnologyE-AB-20036
抗肌动蛋白抗体Abcamab179467
抗GAPDH抗体Abcamab9485
Excellent化学发光底物试剂盒Elabscience BiotechnologyE-IR-R301
ChemiDoc成像系统Bio-Rad Laboratories--
Millipore过滤器Millipore--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
实验设计
品种(荷斯坦牛 vs. 莫迪卡纳牛)、饲养系统(放牧 vs. TMR)、每组规模(n=30)、试验持续时间(5个月)
阅读提示:Materials and Methods 4.2-4.3
牛奶及乳制品样品采集
采样频率(每月一次,共5个月)、样品类型(牛奶、乳清、乳清干酪、莫扎里拉奶酪)、制备细节(离心、过滤、3 kDa截留)
阅读提示:Materials and Methods 4.4
生物分子分析
HPLC-ESI-MS/MS方法参数(流动相0.1%甲酸、流速100 μL/min、进样量10 μL)、定量方法(标准曲线)
阅读提示:Materials and Methods 4.5
抗氧化活性测定
TAC和FRAP试剂盒型号及操作步骤、Trolox和亚铁标准曲线
阅读提示:Materials and Methods 4.6
细胞培养和处理
TeloHAEC细胞培养条件(培养基、补充剂、37°C、5% CO2)、牛奶提取物制备、IL-6浓度(20 ng/mL)、预处理时间和剂量(16小时,20% v/v)
阅读提示:Materials and Methods 4.7
体外功能实验
细胞活力(CCK-8)、炎症因子(ELISA)、NO(NO检测试剂盒)、氧化应激(MitoSOX、Amplex Red)、凋亡(Annexin V/PI)、自噬(自噬检测试剂盒)的具体实验条件
阅读提示:Materials and Methods 4.8-4.13
统计分析
统计方法(ANOVA for repeated measures)、显著性水平(p < 0.05)、重复数(n=5)
阅读提示:Materials and Methods 4.15