高通量筛选NF-κB抑制剂
鉴定能抑制NF-κB激活的化合物
使用Prestwick化学库（1270种FDA批准药物）处理U2OS细胞，通过免疫荧光检测NEMO斑点形成，筛选出4种命中物，其中Auranofin效果最强。
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FDA批准药物Auranofin对SARS-CoV-2进入和NF-κB信号传导具有双重抑制作用
The FDA-approved drug Auranofin has a dual inhibitory effect on SARS-CoV-2 entry and NF-κB signaling.
实验完整度
高包含高通量筛选、体外抗病毒实验、机制研究（NF-κB信号、内吞、ACE2扩散）等多层级验证。
主要模型
U2OS细胞 Vero E6细胞 A549-hACE2细胞 Calu-3细胞
重点核对
Auranofin作用浓度：5μM预处理90分钟用于NF-κB实验，2.5μM用于SARS-CoV-2感染实验 SARS-CoV-2感染实验：MOI 0.05，感染48小时（Calu-3）或MOI 0.01，感染48小时（其他细胞） 抗病毒活性检测：RT-qPCR检测E基因，MTS法检测细胞活力 内吞实验：使用CTxB-FITC、EGF-Alexa555和Transferrin-A488，在4℃结合后转37℃内吞
摘要
化学；生物化学；医学生物化学；分子生物学。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FDA批准的药物Auranofin是否能够抑制SARS-CoV-2感染和炎症反应，其作用机制是什么？
- 核心机制
- Auranofin抑制NF-κB信号通路的早期事件，防止NEMO泛素化及其向TNF-RSC募集；同时抑制脂筏依赖的内吞途径并增加ACE2在质膜上的扩散，从而阻断病毒进入。
- 主要证据
- 在U2OS细胞中，Auranofin抑制IL-1/TNF-α诱导的NEMO复合物形成、IKK磷酸化和IκBα降解；在Vero E6、A549-hACE2和Calu-3细胞中，Auranofin剂量依赖性地抑制SARS-CoV-2复制，EC50在0.9-1.8μM；内吞实验显示Auranofin抑制CTxB和EGF的内吞但不影响转铁蛋白。
- 研究意义
- Auranofin可能作为COVID-19的候选治疗药物，通过抑制病毒进入和炎症反应改善重症患者的预后，但需进一步体内和临床研究验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Auranofin抑制NF-κB通路
确认Auranofin对NF-κB信号传导的抑制作用及其作用位点
用Auranofin预处理U2OS细胞，然后刺激IL-1、TNF-α或LPS，通过Western blot检测IKK磷酸化和IκBα降解，并通过免疫沉淀检测NEMO募集和泛素化。
评估Auranofin对SARS-CoV-2感染的影响
检测Auranofin是否抑制SARS-CoV-2复制
在Vero E6、A549-hACE2和Calu-3细胞中，先用Auranofin预处理2小时，然后感染SARS-CoV-2（MOI 0.01），48小时后通过RT-qPCR检测病毒RNA，并用MTS法评估细胞活力。
研究Auranofin对病毒进入和膜动力学的影响
确定Auranofin抑制SARS-CoV-2进入的机制
通过使用荧光标记的病毒样颗粒（VLP）进行内吞实验，以及用CTxB、EGF和转铁蛋白检测内吞途径，同时用FCS测量ACE2的扩散系数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 金诺芬 | Sigma Aldrich | A6733 |
| 瑞德西韦 | TEBU | 282T7766 | |
| 甲磺酸卡莫司他 | Sigma Aldrich | SML0057 | |
| 小白菊内酯 | Sigma Aldrich | P0667 | |
| ML120B | Sigma Aldrich | 783348-36-7 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco Life Technologies | 11560636 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco Life Technologies | 11548876 | |
| Western blot | 抗NEMO抗体 | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc8330 |
| 抗磷酸化IKKα/β抗体 | Cell Signaling Technology | 16A6 | |
| 抗IκBα抗体 | Becton Dickinson | 610690 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T4026 | |
| 抗ACE2抗体 | R&D | AF3437 | |
| 细胞培养 | A549-hACE2细胞 | ECACC | -- |
| Vero E6细胞 | ECACC | -- | |
| Calu-3细胞 | Elabscience | EP-CL-0054 | |
| U2OS细胞 | ATCC | HTB-96 | |
| RT-qPCR | Luna细胞裂解模块 | New England Biolabs | E3032S |
| 细胞活力检测 | MTS检测 | Promega | G5421 |
| 胆固醇检测 | Amplex Red胆固醇检测试剂盒 | Life Technologies | A12216 |
| 内吞实验 | 霍乱毒素-FITC | Merck | C1655 |
| 转铁蛋白Alexa 488 | Thermo Fisher | T13342 | |
| 生物素化EGF/链霉亲和素Alexa 555 | Thermo Fisher | E35350 | |
| 细胞融合实验 | HEK 293T细胞 | -- | -- |
| 脂质分析 | NR12S | Tocris Bioscience | 1221739-85-0 |
| 共聚焦显微镜 | LSM780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 高内涵筛选 | Opera Phenix高内涵筛选系统 | Perkin Elmer | -- |
| 流式细胞术 | LSRFortessa流式细胞分析仪 | Becton-Dickinson Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NF-κB抑制实验 | Auranofin浓度和预处理时间；刺激物（IL-1, TNF-α, LPS）浓度和刺激时间 阅读提示：图2及方法部分'Cell lysis, immunoprecipitation and immunoblotting' |
| SARS-CoV-2感染实验 | 细胞系；MOI；感染时间；Auranofin浓度；病毒RNA检测方法（RT-qPCR） 阅读提示：图3及方法部分'Assessment of antiviral activity' |
| 内吞实验 | Auranofin浓度；标记物浓度（CTxB, EGF, Transferrin）；结合温度和时间；内吞时间 阅读提示：图6及方法部分'Endocytosis assays' |