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        肥大细胞中PAF-AH2产生的Omega-3脂肪酸环氧化物调节肺血管重塑

        Omega-3 fatty acid epoxides produced by PAF-AH2 in mast cells regulate pulmonary vascular remodeling.

        作者信息Hidenori Moriyama, Jin Endo, Masaharu Kataoka, Yuta Shimanaka, Nozomu Kono, Yuki Sugiura, Shinichi Goto, Hiroki Kitakata, Takahiro Hiraide, Naohiro Yoshida, Sarasa Isobe, Tsunehisa Yamamoto, Kohsuke Shirakawa, Atsushi Anzai, Yoshinori Katsumata, Makoto Suematsu, Kenjiro Kosaki, Keiichi Fukuda, Hiroyuki Arai, Motoaki Sano
        PMID35641514
        期刊Nat Commun
        发布时间2022-05-31
        DOI10.1038/s41467-022-30621-z
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包括体内基因敲除小鼠模型、细胞实验、脂质组学、全外显子测序和分子动力学模拟等多个证据层级，并包含功能验证和机制验证。

        主要模型

        低氧诱导PH小鼠模型 Pafah2基因敲除小鼠 肥大细胞缺陷KitW-sh/W-sh小鼠 Sugen/低氧PH小鼠模型

        重点核对

        PAF-AH2在肥大细胞中的表达 ω-3环氧化物水平（17,18-EpETE和19,20-EpDPE） TGF-β信号通路抑制 Pafah2突变对蛋白稳定性的影响

        摘要

        肺动脉高压是一种致命的罕见疾病，通过升高肺动脉阻力导致右心衰竭。针对肺血管重塑的治疗药物开发存在未满足的医疗需求。血管周围炎症细胞产生的生物活性脂质可能调节血管重塑。在这里，我们展示了由PAF-AH2（一种氧化磷脂选择性磷脂酶A2）从肥大细胞释放的ω-3脂肪酸衍生的环氧化物（ω-3环氧化物）负向调节肺动脉高压。小鼠中Pafah2的基因缺失加速血管重塑，导致低氧性肺动脉高压加重。ω-3环氧化物治疗通过抑制TGF-β信号传导来抑制肺成纤维细胞活化。在体内，ω-3环氧化物补充剂在几种动物模型中减弱了肺动脉高压的进展。此外，对肺动脉高压患者进行全外显子组测序，鉴定出Pafah2的两个候选致病性变异。我们的发现支持PAF-AH2-ω-3环氧化物产生轴可能成为肺动脉高压的有前景的治疗靶点。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        ω-3脂肪酸环氧化物是否参与肺动脉高压的发病，并探讨其机制和治疗潜力。
        核心机制
        肥大细胞通过PAF-AH2产生ω-3环氧化物，通过抑制TGF-β信号通路抑制肺成纤维细胞活化，从而抑制肺血管重塑。
        主要证据
        Pafah2敲除小鼠低氧PH加重，ω-3环氧化物补充改善PH；体外实验显示ω-3环氧化物抑制TGF-β诱导的成纤维细胞活化及Smad2磷酸化。
        研究意义
        PAF-AH2-ω-3环氧化物轴可能成为肺动脉高压的治疗靶点，尤其对现有治疗反应不佳的患者。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        脂质组学分析

        鉴定PH肺组织中显著变化的脂肪酸代谢物。

        对低氧诱导PH小鼠肺组织进行LC-MS/MS脂质组学分析，检测EPA、DHA和AA代谢物。

        2

        基因敲除小鼠表型分析

        确定PAF-AH2在PH发展中的作用。

        比较Pafah2 KO小鼠与WT小鼠在低氧条件下的PH严重程度，包括血管重塑、RVSP、右心室肥厚、存活率等。

        3

        细胞来源鉴定

        确定肺中产生ω-3环氧化物的细胞类型。

        通过免疫荧光染色检测PAF-AH2在肺中的表达细胞，并利用肥大细胞缺陷小鼠进行骨髓移植实验。

        4

        体外细胞功能实验

        验证ω-3环氧化物对肺成纤维细胞活化的影响。

        用BMMC培养上清脂质提取物或ω-3环氧化物处理原代肺成纤维细胞，检测增殖、活化标志物及TGF-β信号。

        5

        体内给药验证

        评估ω-3环氧化物对PH模型的治疗作用。

        在慢性低氧和Sugen/低氧PH小鼠模型中，腹腔注射19,20-EpDPE，评估PH严重程度。

        6

        人类遗传学分析

        鉴定PAH患者中PAF-AH2的致病性变异。

        对262例PH患者进行全外显子组测序，筛选Pafah2变异，并在HEK293细胞中验证突变蛋白表达。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        脂质组学分析
        基于LC-MS/MS的脂质组学
        验证样本或模型特征
        蛋白质印迹免疫组织化学甲苯胺蓝染色
        验证细胞功能变化
        细胞增殖实验迁移实验
        验证分子表达变化
        实时荧光定量PCR
        验证免疫效应
        流式细胞术β-己糖胺酶释放实验
        验证机制链路
        分子动力学模拟
        评估体内效果
        血流动力学测量组织学分析
        数据分析与统计
        全外显子组测序统计分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        脂质组学分析岛津Nexera超高效液相色谱系统Shimadzu--
        QTRAP 4500混合三重四极杆线性离子阱质谱仪AB SCIEX--
        ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱Waters--
        脂质提取InertSep NH2固相萃取柱GL Science--
        11(12)-EET-d11----
        细胞培养DMEM培养基Wako--
        EGM-2 BulletKit培养基LonzaCC-3162
        胎牛血清----
        青霉素----
        链霉素----
        L-谷氨酰胺----
        非必需氨基酸----
        小鼠重组IL-3----
        药物处理17,18-环氧二十碳四烯酸Cayman Chemical--
        19,20-环氧二十二碳五烯酸Cayman Chemical--
        17,18-二羟基二十碳四烯酸Cayman Chemical--
        19,20-二羟基二十二碳五烯酸Cayman Chemical--
        14,15-环氧二十碳三烯酸Cayman Chemical--
        二十碳五烯酸Cayman Chemical--
        二十二碳六烯酸Cayman Chemical--
        花生四烯酸Cayman Chemical--
        Sugen (SU5416)Sigma-AldrichS8442
        二甲基草酰甘氨酸 (DMOG)----
        富马酸酮替芬Sigma--
        MG132----
        细胞增殖分析RealTime-Glo MT细胞活力检测试剂盒Promega--
        CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒Promega--
        细胞迁移分析Boyden腔实验（24孔，8μm孔径膜侵袭小室）ThermoFisher--
        氧化应激测定细胞活性氧检测试剂盒abcam--
        蛋白质印迹抗PAF-AH2抗体 (TI10)----
        抗β-肌动蛋白抗体 (sc-47778)Santa Cruz Biotechnologysc-47778
        抗磷酸化Smad2抗体 (S465/467) (#3108)Cell Signaling Technology3108
        抗Smad2抗体 (#5339)Cell Signaling Technology5339
        辣根过氧化物酶标记的二抗----
        Chemi-Lumi One Super化学发光底物Nacalai Tesque--
        LAS-4000 mini成像系统GE healthcare--
        ImageJ ver1.52软件----
        RNA提取和RT-qPCRTrizol试剂Invitrogen--
        High Capacity cDNA逆转录试剂盒Applied Biosystems--
        THUNDERBIRD SYBR qPCR预混液Toyobo--
        ViiA7实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems--
        免疫组织化学靶向抗原修复液S1700DakoS1700
        抗CD31抗体 (E-AB-70021)ElabscienceE-AB-70021
        抗CD31抗体 (ab182981)Abcamab182981
        Alexa488偶联的山羊抗兔IgGInvitrogen--
        抗波形蛋白抗体 (ab8978)Abcamab8978
        M.O.M.荧光免疫检测试剂盒Vector Laboratories--
        亲和素/生物素封闭试剂盒Vector Laboratories--
        链霉亲和素Texas RedVector Laboratories--
        抗类胰蛋白酶抗体 (NPB2-26444)NovusNPB2-26444
        链霉亲和素AMCAVector Laboratories--
        HiLyte Fluor 555标记试剂盒Dojindo Molecular Technologies--
        含DAPI的Fluoromount-G封片剂Invitrogen--
        Fluoromount封片剂Diagnostic BioSystems--
        荧光显微镜 (BZ-9000)Keyence--
        抗Podoplanin抗体 (AF3244)R&D SystemsAF3244
        抗Mac3抗体 (550292)BD Biosciences550292
        抗波形蛋白抗体 (ab92547)Abcamab92547
        抗Podoplanin抗体 (AF3670)R&D SystemsAF3670
        抗CD68抗体 (#76437)Cell Signaling Technology76437
        Alexa594偶联的驴抗绵羊IgGInvitrogen--
        Alexa594偶联的山羊抗兔IgGInvitrogen--
        Alexa488偶联的山羊抗小鼠IgGInvitrogen--
        免疫细胞化学抗SM22α抗体 (ab14106)Abcamab14106
        抗PCNA抗体 (ab29)Abcamab29
        细胞培养胶原酶IIWorthington Biochemical Crop--
        Primaria培养皿BD--
        人肺内皮细胞Gibco--
        人肺动脉平滑肌细胞Kurabo--
        质粒构建和转染pcDNA3.1(+)质粒载体InvitrogenV790202
        Quik Change定点突变试剂盒Agilent--
        Lipofectamine 2000转染试剂Invitrogen--
        全外显子测序HiSeq 2500测序平台Illumina--
        SureSelectXT人类全外显子捕获试剂盒Agilent Technologies--
        分子动力学模拟NAMD 2.12版软件----
        CHARMM36力场----
        VMD 1.9.3版软件----
        动物实验低氧舱（10%氧气）TEIJIN--
        氧气分析仪 (JIKO-255)--JIKO-255

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        脂质组学分析
        小鼠品系、低氧暴露时间（4、14、28天）、样本量（每组3只）、LC-MS/MS参数
        阅读提示：Methods中的“Quantification of fatty acid metabolites”部分
        基因敲除小鼠模型
        Pafah2 KO小鼠的构建方法、低氧暴露时间（8周）、样本量、RVSP测量方法
        阅读提示：Methods中的“Animals”和“Experimental PH models”部分
        骨髓来源肥大细胞重建
        BMMCs的制备和培养条件（IL-3浓度、培养时间）、重建细胞数量（5×10^6）、低氧暴露时间（4周）
        阅读提示：Methods中的“Generation of mouse BMMCs”和“Adoptive transfer of BMMCs”部分
        体外细胞实验
        肺成纤维细胞分离和培养条件、处理浓度和时长（ω-3环氧化物1μM，48h）、TGF-β浓度（2.5ng/ml）
        阅读提示：Methods中的“Isolation and culture of primary lung fibroblasts”部分
        体内给药实验
        19,20-EpDPE剂量（0.05mg/kg/day）、给药途径（腹腔注射）、给药时间（低氧后2周开始）
        阅读提示：Methods中的“Experimental PH models”部分
        人类遗传学分析
        患者队列特征（例数、分型）、外显子测序平台和捕获试剂盒、变异筛选标准（CADD≥30）
        阅读提示：Methods中的“Whole-exome sequencing of human PH patients”部分

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