确认∆Np73稳定过表达
验证HCT116细胞中∆Np73的稳定过表达，为后续实验奠定基础。
通过qPCR确认HCT116-∆Np73细胞中∆Np73 mRNA水平高于Mock对照细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
∆Np73效应物的深入蛋白质组学表征鉴定出与结直肠癌淋巴管生成、血管生成和转移相关的具有诊断潜力的关键蛋白
In-depth proteomics characterization of ∆Np73 effectors identifies key proteins with diagnostic potential implicated in lymphangiogenesis, vasculogenesis and metastasis in colorectal cancer.
实验完整度
高研究包含体外细胞模型（HCT116、HUVEC、HLEC）、动物模型（小鼠尾静脉注射）及患者样本（血浆）等多个独立证据层级，并通过siRNA沉默、功能实验及ELISA验证了分子机制和临床诊断价值。
主要模型
HCT116结肠癌细胞系 HCT116 p53−/−细胞系 HUVEC人脐静脉内皮细胞 HLEC人淋巴内皮细胞 免疫缺陷小鼠（nu/nu）
重点核对
HCT116细胞稳定转染∆Np73或空载体（Mock） SILAC标记中重同位素掺入率>98% 差异蛋白筛选阈值：倍数变化≥1.5或≤0.67，变异性≤20% BDNF和EMAP-II的siRNA沉默效率分别为约75%和85% 血浆样本分组：CRC患者（n=20）、癌前病变个体（n=20）、对照（n=20）
摘要
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。p53家族蛋白的改变是CRC中的常见事件。ΔNp73是p53家族成员，具有致癌特性，其效应物在很大程度上未知。我们对人结肠癌细胞分泌组中∆Np73的转录控制进行了深入的蛋白质组学表征，并验证了其临床潜力。使用高密度抗体微阵列和稳定同位素代谢标记分析了分泌组。通过半定量PCR、ELISA、斑点印迹和western blot分析进行验证。使用来自CRC患者、携带癌前结直肠病变的个体和结肠镜阴性对照的60份血浆样本对选定的效应物进行了评估。总共观察到51种失调蛋白，其表达变化至少1.5倍。我们发现∆Np73的过表达与淋巴管生成、血管生成和转移相关的效应物之间存在重要关联，例如脑源性神经营养因子（BDNF）和假定的氨酰tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白1（EMAP-II）-血管内皮生长因子C-血管内皮生长因子受体3轴。我们进一步证明了BDNF作为潜在CRC生物标志物的有用性，能够以高灵敏度和特异性区分CRC患者和癌前个体与对照组。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在鉴定∆Np73在结直肠癌细胞分泌组中的下游效应物，并探讨其在肿瘤进展中的功能及其作为诊断生物标志物的潜力。
- 核心机制
- ∆Np73通过调控分泌性效应物（如上调BDNF，下调EMAP-II）激活VEGFC-VEGFR3轴，促进淋巴管生成、血管生成和转移。
- 主要证据
- 通过抗体微阵列和SILAC蛋白质组学在HCT116细胞分泌组中鉴定出51种失调蛋白；通过PCR、WB、ELISA验证了BDNF和EMAP-II的失调；体外功能实验（管形成、迁移）及体内小鼠模型证实∆Np73促进血管和淋巴管生成；血浆ELISA显示BDNF可区分CRC患者和对照组。
- 研究意义
- 研究揭示了∆Np73在CRC中新的致癌功能，并鉴定出BDNF作为潜在的早期诊断生物标志物，为CRC的诊断和治疗提供了新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分泌组蛋白组学分析
系统性鉴定∆Np73过表达导致的分泌蛋白变化。
使用高密度抗体微阵列和SILAC技术分析HCT116-∆Np73和Mock细胞的条件培养基，鉴定差异表达蛋白。
差异蛋白验证
验证蛋白质组学发现，确认mRNA和蛋白水平的失调。
通过半定量PCR、ELISA、斑点印迹和Western blot验证选定的失调蛋白（如BDNF、EMAP-II），并在HCT116 p53−/−细胞中进一步确认。
血浆生物标志物评估
评估∆Np73效应物作为CRC血浆生物标志物的诊断价值。
使用ELISA检测CRC患者、癌前病变个体和对照血浆中BDNF、EMAP-II、VEGFC和VEGFR3水平，并通过ROC曲线评估诊断性能。
体外功能实验
评估∆Np73及其效应物对血管生成和淋巴管生成的影响。
使用HUVEC和HLEC细胞，通过MTT增殖实验、Transwell迁移/侵袭实验和管形成实验，评估HCT116-∆Np73条件培养基的作用，并通过siRNA沉默BDNF和EMAP-II进一步验证。
体内转移实验
评估∆Np73在体内的转移潜能。
通过尾静脉注射HCT116-∆Np73或Mock细胞至免疫缺陷小鼠，3周后检查肺、肝和肾的宏转移灶。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Corning | #10-013-CVR |
| 胎牛血清 | Corning | #35-079-CV | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | #25030-081 | |
| 青霉素/链霉素 | Corning | #30-009-CI | |
| 两性霉素B | Corning | #30-003-CF | |
| 内皮细胞培养基 | Innoprot | #P60104 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗体微阵列 | RayBio标记人抗体阵列493 | Raybiotech | -- |
| 细胞培养 | 台盼蓝 | Invitrogen | -- |
| SILAC | 重赖氨酸和精氨酸 | Dundee Cell Products | -- |
| 蛋白质组学 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| ZipTip C18吸头 | Millipore | -- | |
| 质谱分析 | LTQ-OrbitrapVelos质谱仪 | Thermo-Scientific | -- |
| nanoEasy高效液相色谱 | Proxeon | -- | |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | GE-Healthcare | -- |
| 辣根过氧化物酶标记抗鼠IgG | Sigma | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔IgG | Sigma | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记链霉亲和素 | RayBiotech | -- | |
| SuperSignal West Pico最大灵敏度底物 | Pierce | -- | |
| RNA提取 | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| NanoDrop ND-1000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| cDNA合成 | Superscript III第一链合成试剂盒 | Invitrogen | -- |
| PCR | GelRed核酸染料 | Biotium | -- |
| qPCR | LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I试剂盒 | Roche Diagnostics | -- |
| ELISA | VEGF-C ELISA试剂盒 | RayBiotech | -- |
| VEGFR-3 ELISA试剂盒 | RayBiotech | -- | |
| BDNF ELISA试剂盒 | RayBiotech | -- | |
| EMAP-II ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 增殖实验 | MTT试剂 | Cayman Chemical Company | -- |
| 迁移实验 | CellTracker绿色CMFDA荧光染料 | Invitrogen | #C2925 |
| 生长因子减少型Matrigel | BD Bioscience | -- | |
| siRNA转染 | 阴性对照siRNA | Invitrogen | AM4611 |
| BDNF siRNA | Dharmacon | #L017626-00-0005 | |
| AIMP1 siRNA | Sigma-Aldrich | EHU075101 | |
| JetPrime转染试剂 | Polyplus Transfection | -- | |
| 管形成实验 | μ-Slide血管生成板 | Ibidi | #81506 |
| 动物实验 | nu/nu裸鼠 | Charles River | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与稳定转染 | HCT116细胞培养条件（DMEM+10%FBS），稳定转染使用pEF1α-ΔNp73β-IRES-GFP或空载体，Lipofectamine 2000转染，GFP分选筛选 阅读提示：见Materials and methods 2.1 |
| 分泌组样品制备 | 细胞接种密度（5×10^6），无血清培养基孵育时间（48小时），细胞活力（>95%），蛋白浓度测定（Trp法） 阅读提示：见Materials and methods 2.2.1 |
| SILAC标记 | 重氨基酸掺入率（>98%），标记代数（至少8代），正向和反向实验以消除标记偏差 阅读提示：见Materials and methods 2.2.2 |
| 质谱分析 | 色谱柱（C18），梯度（170分钟，0-35% Buffer B），质谱仪（LTQ-OrbitrapVelos），扫描范围（m/z 400-1200），搜索参数（SwissProt数据库，10 ppm前体容差） 阅读提示：见Materials and methods 2.2.3 |
| 蛋白验证 | 一抗优化稀释度，二抗稀释度（HRP-anti-mouse IgG 1:2500，HRP-anti-rabbit IgG 1:2500），上样量（25μg细胞提取物或5μg条件培养基） 阅读提示：见Materials and methods 2.4及Table S1 |
| 血浆样本 | 样本分组（CRC、癌前病变、对照各20例），ELISA试剂盒灵敏度（VEGF-C/VEGFR-3 15pg/mL，BDNF 80pg/mL，EMAP-II 75pg/mL） 阅读提示：见Materials and methods 2.6及Table S2 |
| 功能实验 | 细胞类型（HUVEC/HLEC，传代2-6），管形成实验条件（Matrigel GFR，μ-Slide板），siRNA浓度及转染时间（BDNF 24h，AIMP1 48h） 阅读提示：见Materials and methods 2.7 |
| 体内实验 | 小鼠品系（nu/nu雌性，6周龄），细胞注射数量，观察时间（3周），评估器官（肺、肝、肾） 阅读提示：见Materials and methods 2.8 |