建立OGD/R细胞模型
模拟缺血再灌注损伤，评价14,15-EET的保护作用。
将人脑微血管内皮细胞HCMEC/D3置于无血清无糖培养基中，在缺氧环境（5% CO2, 95% N2）中培养4小时，再复氧24小时。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
14,15-环氧二十碳三烯酸通过SIRT1/FOXO3a信号通路和TSPO蛋白调节线粒体自噬，保护脑微血管内皮细胞免受葡萄糖剥夺和再灌注损伤
14,15-Epoxyeicosatrienoic Acid Protect Against Glucose Deprivation and Reperfusion-Induced Cerebral Microvascular Endothelial Cells Injury by Modulating Mitochondrial Autophagy via SIRT1/FOXO3a Signaling Pathway and TSPO Protein.
实验完整度
中包含体外细胞模型、siRNA敲低、药物干预、流式、Western blot等功能和机制验证，但缺乏动物模型和临床样本。
主要模型
人脑微血管内皮细胞系HCMEC/D3 OGD/R体外模型
重点核对
14,15-EET浓度为1 μM，预处理30分钟 3-MA浓度为5 mM，处理2小时 OGD条件：无血清无糖DMEM/F12，缺氧4小时，复氧24小时 siRNA转染6小时，靶向SIRT1和TSPO CCK-8检测细胞活力，流式细胞术检测凋亡
摘要
神经血管系统在控制脑实质组织血流中起重要作用。此外，它还促进神经元生物活动中的代谢。脑微血管内皮细胞(MECs)参与介导与脑血管相关的疾病(包括中风)的进展。花生四烯酸可在细胞色素P450环氧酶催化下转化为环氧二十碳三烯酸(EETs)。我们已报道EETs可以保护神经元功能。在我们的研究中，进一步阐明了14,15-EET在脑MECs保护作用中的角色以及氧糖剥夺和再灌注(OGD/R)中涉及的潜在机制。在我们的研究中，我们干预了SIRT1/FOXO3a通路，并通过RNA干扰技术建立了TSPO敲低模型，以探索14,15-EET在OGD/R损伤中的细胞保护作用。OGD/R处理后脑MECs活力显著降低，但14,15-EET可以逆转这种效应。为了进一步确认14,15-EET是否由SIRT1/FOXO3a信号通路和转位蛋白(TSPO)介导，我们还检测了自噬相关蛋白、线粒体膜电位、凋亡指标、氧自由基等。结果发现，14,15-EET可以调节OGD/R诱导的线粒体自噬。SIRT1/FOXO3a信号通路和TSPO调节与14,15-EET在脑MECs中的保护作用有关。此外，我们还探讨了SIRT1/FOXO3a信号通路与TSPO蛋白之间的潜在关系。我们的研究揭示了14,15-EET在OGD/R条件下脑MECs中的保护作用及其潜在机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 14,15-EET在OGD/R条件下对脑微血管内皮细胞是否具有保护作用及其潜在机制。
- 核心机制
- 14,15-EET通过激活SIRT1/FOXO3a信号通路和上调TSPO蛋白表达，调节线粒体自噬，从而保护脑微血管内皮细胞免受OGD/R损伤。
- 主要证据
- 体外OGD/R模型中，14,15-EET处理后细胞活力增加、凋亡减少、线粒体膜电位恢复、LC3II/LC3I比值升高、P62水平降低，SOD活性升高、MDA含量降低；siRNA敲低SIRT1或TSPO后这些效应被逆转。
- 研究意义
- 研究揭示了14,15-EET在脑缺血损伤中的保护作用和潜在机制，为脑缺血性损伤的治疗提供新的见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
14,15-EET预处理及分组干预
评估14,15-EET的细胞保护作用以及SIRT1/FOXO3a和TSPO的参与。
细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+14,15-EET组、OGD/R+14,15-EET+3-MA组、OGD/R+14,15-EET+siRNA组等，在OGD/R前给予14,15-EET（1 μM）30分钟，或加用3-MA（5 mM）2小时，或siRNA转染6小时。
检测细胞活力与凋亡
评估14,15-EET对OGD/R诱导的细胞损伤的保护作用。
使用CCK-8检测细胞活力，使用流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染）检测细胞凋亡。
检测线粒体膜电位
评估14,15-EET对OGD/R诱导的线粒体功能障碍的影响。
使用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（ΔΨm），通过荧光显微镜观察红/绿荧光比值。
检测线粒体自噬相关蛋白表达
评估14,15-EET对OGD/R诱导的线粒体自噬的影响。
通过Western blot检测LC3、P62、SIRT1、FOXO3a和TSPO蛋白表达水平。
检测氧化应激指标
评估14,15-EET对OGD/R诱导的氧化应激的影响。
使用ELISA试剂盒检测MDA含量和SOD活性。
生物信息学分析
探索SIRT1/FOXO3a通路与TSPO蛋白之间的潜在关联。
使用STRING数据库构建PPI网络，MCODE筛选关键模块，CytoHubba识别hub基因，并进行GO和通路富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 14,15-环氧二十碳三烯酸 | Cayman Chemical Corporation | -- |
| Western blot | 抗SIRT1抗体 | CST | 8469 |
| 抗TSPO抗体 | CST | 70358 | |
| 抗LC3抗体 | CST | 12741 | |
| 抗P62抗体 | CST | 23214 | |
| 抗FOXO3a抗体 | CST | 12829 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | Ab8245 | |
| 细胞培养 | 内皮细胞培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 谷氨酰胺 | -- | -- | |
| OGD/R模型 | 无血清无葡萄糖的DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 药物处理 | 3-甲基腺嘌呤 | -- | -- |
| ELISA | 丙二醛ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 超氧化物歧化酶ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 流式分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 异硫氰酸荧光素标记的Annexin V | -- | -- | |
| FACS Calibur细胞分选仪 | BD | -- | |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 增强化学发光检测系统 | Tanon | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| ELISA检测 | 酶标仪 | BioTek | -- |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1荧光染料 | -- | -- |
| 荧光显微镜 | Leica | -- | |
| 数据统计 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：HCMEC/D3；培养基：Endothelial Cell Medium添加10% FBS、1%青霉素/链霉素、1%谷氨酰胺；培养条件：37°C，5% CO2。 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture |
| OGD/R模型 | OGD条件：无血清无糖DMEM/F12，缺氧4小时（5% CO2, 95% N2）；复氧条件：正常培养环境，24小时。 阅读提示：Materials and Methods - Oxygen Glucose Deprivation and Reoxygenation |
| 药物处理 | 14,15-EET浓度1 μM，预处理30分钟；3-MA浓度5 mM，处理2小时；siRNA转染6小时。 阅读提示：Materials and Methods - Cell Culture, Results 图1 |
| 细胞活力与凋亡检测 | CCK-8检测：OGD/R后24小时加入，孵育2小时，OD 480 nm；流式凋亡：Annexin V-FITC/PI染色，PI 10 μl，FITC 5 μl。 阅读提示：Materials and Methods - Flow Cytometry, Cell Viability Assay |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1染色：37°C孵育15分钟；红/绿荧光比值分析。 阅读提示：Materials and Methods - JC-1 Fluorescence Measurement |
| 蛋白表达检测 | Western blot：蛋白上样量15 μg，SDS-PAGE 10%，转移至硝酸纤维素膜，BSA封闭1小时，一抗孵育。 阅读提示：Materials and Methods - Western Blot Analysis |