体外培养细胞信号通路分析
确定candidalysin激活的MAPK通路及EGFR的作用
用TR146细胞，使用多种激酶抑制剂和candidalysin刺激，通过免疫印迹检测信号蛋白磷酸化。
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白色念珠菌毒素Candidalysin通过p38和EGFR-ERK通路介导不同的上皮炎症反应
The Candida albicans toxin candidalysin mediates distinct epithelial inflammatory responses through p38 and EGFR-ERK pathways.
实验完整度
高包含体外培养细胞（TR146）通路抑制剂、siRNA敲低、免疫印迹、ELISA等验证，以及小鼠OPC模型体内实验和Fos条件敲除小鼠验证，多层级证据支持。
主要模型
TR146人口腔上皮细胞 BALB/c小鼠OPC模型 C57BL/6小鼠OPC模型 FosK13上皮特异性c-Fos敲除小鼠
重点核对
candidalysin处理浓度70 μM，处理时间30 min（信号）和24 h（细胞因子） BIRB796（10 μM）抑制p38，Gefitinib（2 μM）和PD153035（500 nM）抑制EGFR 小鼠OPC模型中BIRB796给药方案：50 mg/kg腹腔注射，感染前1天开始每12小时一次 FosK13小鼠与Il17ra-/-对照小鼠的感染实验
摘要
真菌病原体白色念珠菌分泌肽毒素candidalysin，该毒素损伤上皮细胞，并通过表皮生长因子受体（EGFR）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路以及转录因子c-Fos驱动先天炎症反应。在培养的口腔上皮细胞（OEC）中，candidalysin激活p38 MAPK信号通路，导致热休克蛋白27（Hsp27）激活、IL-6释放和EGFR磷酸化，而不影响c-Fos的诱导。p38的激活并非由EGFR触发，而是由涉及MAPK激酶（MKK）和激酶Src的两条非冗余通路触发，这两条通路差异性地控制p38信号输出。MKK主要促进p38依赖性IL-6的释放，而Src以不依赖配体的方式促进p38介导的EGFR磷酸化。同时，candidalysin还以依赖EGFR配体的方式激活EGFR-ERK通路，导致c-Fos激活和中性粒细胞激活趋化因子G-CSF和GM-CSF的释放。在小鼠中，p38对口腔白色念珠菌感染的早期清除事件很重要，但c-Fos则不然。这些发现描述了candidalysin如何激活p38和ERK MAPK通路，这些通路在白色念珠菌感染期间差异性促进免疫激活。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- candidalysin如何激活口腔上皮细胞中的MAPK信号通路，以及这些通路如何差异性调控炎症反应和对白色念珠菌感染的免疫？
- 核心机制
- candidalysin通过两条独立通路激活口腔上皮细胞：EGFR-ERK1/2-c-Fos通路（依赖EGFR配体）和MKK3/6或Src驱动的p38通路；p38磷酸化EGFR（不依赖配体）并促进IL-6释放，而ERK1/2促进c-Fos及G-CSF/GM-CSF释放。
- 主要证据
- 在TR146细胞中使用激酶抑制剂（如Gefitinib、BIRB796）和siRNA敲低（如MKK3/6、Src）显示p38和ERK1/2独立激活；免疫印迹显示p38磷酸化EGFR（Tyr1068）和Hsp27，ELISA显示IL-6和GM-CSF释放；小鼠OPC模型中BIRB796抑制p38增加真菌载量，而Fos敲除不影响清除。
- 研究意义
- 该研究阐明了candidalysin激活MAPK通路的机制，并指出p38在急性口腔白色念珠菌感染早期宿主防御中的保护作用，而c-Fos非必需。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞因子释放分析
明确各通路对candidalysin诱导的细胞因子释放的贡献
在抑制剂存在下用candidalysin处理TR146细胞24小时，使用Luminex和ELISA检测细胞因子。
p38上游激活机制研究
鉴定candidalysin激活p38的上游激酶及其差异性输出
通过siRNA敲低MKK3/6、MKK4和Src抑制剂处理，评估p38磷酸化及下游信号。
小鼠OPC模型验证p38和c-Fos的体内作用
评估p38和c-Fos在白色念珠菌感染中的功能相关性
使用BIRB796抑制p38或FosK13小鼠，感染白色念珠菌，评估真菌载量、炎症因子表达和组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 信号通路抑制 | BIRB796 | Selleckchem | S1574 |
| SB203580 | Selleckchem | S1076 | |
| 吉非替尼 | -- | -- | |
| 曲美替尼 | -- | -- | |
| SP600125 | -- | -- | |
| 达沙替尼 | Selleckchem | S1021 | |
| PD153035 | Selleckchem | S6546 | |
| PP1 | Merck | 0040 | |
| 西妥昔单抗 | Merck KGaA | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Merck | 05892791001 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Merck | PHOSS-RO | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| 4-12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| LI-COR Odyssey CLx成像仪 | LI-COR | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10003D |
| 细胞因子检测 | 磁性Luminex人基础试剂盒A | R&D systems | LUHM000 |
| Bioplex 200 | -- | -- | |
| RNA干扰 | ON-TARGETplus siRNA | Dharmacon | -- |
| HiPerFect转染试剂 | QIAGEN | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy试剂盒 | QIAGEN | 74014 |
| 无RNase DNase套装 | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 100分光光度计 | -- | -- | |
| M-MLV逆转录酶试剂盒 | Promega | M1701 | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | ThermoFisher Scientific | A25742 | |
| QuantStudio 7实时荧光定量PCR系统 | -- | -- | |
| ELISA | 表皮调节素ELISA试剂盒 | ELabscience | -- |
| Epigen ELISA试剂盒 | LSBio | -- | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Invitrogen | KHC0061 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Abcam | Ab178013 | |
| 转录因子结合检测 | TransAM转录因子ELISA系统 | Active Motif | -- |
| 动物实验 | Gentle MACS组织处理器 | Miltenyi Biotec | -- |
| RNeasy Plus Mini试剂盒 | QIAGEN | 74134 | |
| 免疫组织化学 | 抗S100A9抗体 | Abcam | ab105472 |
| Roche Ventana Discovery Ultra自动染色仪 | Roche | -- | |
| Zeiss Axio Scan.Z1玻片扫描仪 | Zeiss | -- | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD45.2抗体 | Biolegend | -- |
| 抗小鼠CD11b抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠Ly6G抗体 | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠Ly6C抗体 | Biolegend | -- | |
| BD FACS Canto II流式细胞仪 | BD | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与刺激 | TR146细胞培养条件（DMEM/F12含10% FBS）、血清饥饿过夜、candidalysin浓度70 μM、抑制剂预处理1小时 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture and treatment with candidalysin |
| 信号通路检测 | 检测时间点（30 min和2 h）、抗体（p-p38, p-EGFR, p-Hsp27）、抑制剂浓度（BIRB796 10 μM, Gefitinib 2 μM等） 阅读提示：Figure 1 legend |
| 细胞因子释放 | 处理时间（24 h）、检测方法（Luminex, ELISA）、抑制剂（BIRB796, SP600125, Trametinib, Gefitinib） 阅读提示：Figure 2 legend |
| siRNA敲低 | siRNA浓度20 nM、转染时间72 h、目标基因（MKK3, MKK6, Src等） 阅读提示：Materials and Methods: RNA Interference |
| 小鼠OPC模型 | 小鼠品系（BALB/c, C57BL/6）、感染剂量（10^7 cfu/ml）、BIRB796给药方案（50 mg/kg, i.p.）、FosK13小鼠 阅读提示：Materials and Methods: Murine oropharyngeal candidiasis model |
| 体内检测 | 真菌载量（tongue homogenates）、qPCR引物、免疫组化（S100A9, c-Fos） 阅读提示：Materials and Methods: Quantitative PCR for mouse samples, Immunohistochemistry |