补肺消积饮改善肺癌伴气阴两虚小鼠的NLRP3炎症反应和肠道菌群

BuFeiXiaoJiYin ameliorates the NLRP3 inflammation response and gut microbiota in mice with lung cancer companied with Qi-yin deficiency.

作者信息Rui-Yuan Jiang, Ting Wang, Qiao-Yu Lan, Yan-Chun Qin, Ting-Ting Man, Hua Sun, Zhu-Long Li, Xiao-Ting Zhong, Chun-Mei Mo, Zhen Rong
PMID35292015
发布时间2022-03-15
DOI10.1186/s12935-022-02543-9

实验完整度

实验包含体外细胞诱导、体内动物模型、药物干预及多项检测,但缺乏机制验证的独立性,且部分结果无统计学差异。

主要模型

A549细胞 BALB/c-nu小鼠肺癌模型 肺癌伴气阴两虚小鼠模型

重点核对

动物品系:雌性BALB/c-nu小鼠,5-6周龄,18-22g 模型建立:气阴两虚模型(灌胃温药、烟熏30分钟/天,连续10天);肿瘤模型(皮下注射0.2ml 1×10^7/ml A549细胞) 给药:BFXJY低、中、高剂量分别为2.5, 5.0, 10.0 g/kg;阳性对照CRID3 1mg/kg;连续27天 样本量:每组5只小鼠(n=5) 统计:单因素方差分析和Duncan检验,p<0.05为显著

摘要

INTRODUCTION: NLRP3 inflammasome responses and gut microbiota have been shown an important role in lung cancer, however, the relationship between gut microbiota and NLRP3 inflammasome responses in lung cancer with Qi-yin deficiency remains elusive.METHODS: To investigate the effect of the traditional Chinese medicine BuFeiXiaoJiYin (BFXJY) on NLRP3 inflammasome responses and dysbiosis in lung cancer with Qi-yin deficiency, the female BALB/cA-nu mice were treated with LPS and ATP to induce inflammation, and were intragastrically treated with warm Chinese medicine and smoked with shavings to induce Qi-yin deficiency, as well as were injected with 1 × 107/ml A549 cells to simulate lung cancer. Then the three different doses of BuFeiXiaoJiYin (BFXJY) and positive control (CRID3) were used for intervention in mice for 27 consecutive days. Then, we estimated the protection effect of BFXJY on lung cancer mice with Qi-yin deficiency, through deterring tumor growth, NLRP3 inflammasome, PKC signaling, and homeostasis of gut microbiota.RESULTS: In this study, we found that BFXJY could inhibit the tumor growth in lung cancer with Qi-yin deficiency by reducing the production of IL-1β and IL-18 and inhibiting NLRP3 inflammasome activation, which might be associated with the inhibition of PKC signaling. Furthermore, BFXJY could promote microbial diversity and balance the microbial composition changes induced by inflammation and Qi-yin deficiency in lung cancer.CONCLUSION: BuFeiXiaoJiYin ameliorates the NLRP3 inflammation response and gut microbiota in mice with lung cancer companied with Qi-yin deficiency. Our study provides a theoretical basis for the clinical development of therapeutic drugs targeting to treat lung cancer.

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
补肺消积饮(BFXJY)对肺癌伴气阴两虚小鼠的NLRP3炎症反应和肠道菌群失调是否具有改善作用?
核心机制
BFXJY通过抑制PKC信号通路,进而抑制NLRP3炎症小体活化,减少IL-1β和IL-18的产生,并调节肠道菌群多样性及组成。
主要证据
动物实验中,BFXJY降低肿瘤体积、血清及蛋白水平IL-1β和IL-18,抑制NLRP3、ASC、pro-caspase-1表达,并升高肠道菌群Shannon和Simpson指数等;但体重和肿瘤体积的变化无统计学差异。
研究意义
为靶向治疗肺癌的临床药物开发提供理论基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

细胞模型建立与炎症诱导

建立A549细胞炎症模型,以模拟肺癌细胞的炎症环境。

A549细胞以1×10^4/孔接种于96孔板,培养24小时后,用1μg/ml LPS处理6小时,再用5μM ATP处理30分钟诱导炎症。

2

动物模型建立

构建肺癌伴气阴两虚小鼠模型,并引入炎症刺激。

雌性BALB/c-nu小鼠,气阴两虚模型(灌胃20g/kg温药,烟熏30分钟/天,连续10天),然后皮下注射0.2ml 1×10^7/ml A549细胞(对照组和单纯气阴两虚组)或经LPS/ATP处理的A549细胞(其余组)。

3

药物干预

评估不同剂量BFXJY和阳性对照对模型小鼠的影响。

在移植后第0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27天灌胃给药,阳性组用CRID3 1mg/kg,低、中、高剂量组分别用BFXJY 2.5, 5.0, 10.0 g/kg,对照组给予生理盐水。

4

肿瘤生长监测与样本收集

监测肿瘤生长,并在实验终点收集血清、肿瘤和盲肠内容物用于后续分析。

在0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27天测量肿瘤体积;第27天处死小鼠,取血、肿瘤组织和盲肠内容物。

5

炎症因子和NLRP3炎症小体检测

检测IL-1β、IL-18等炎症因子和NLRP3炎症小体组分的表达水平。

使用ELISA检测血清IL-1β、IL-18、NLRP3、pro-caspase-1、MDA;Western blot和IHC检测肿瘤组织中IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC、pro-caspase-1;qRT-PCR检测NLRP3和ASC mRNA表达。

6

肠道菌群分析

分析模型和药物干预后肠道菌群的多样性和组成变化。

盲肠内容物提取DNA,扩增16S rDNA V3-V4区域,Illumina MiSeq测序,进行OTU聚类和多样性分析。

7

PKC信号通路检测

探索BFXJY对PKC信号通路的影响。

通过Western blot和IHC检测PKC-α蛋白表达,ELISA检测MDA水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

检测炎症因子水平
检测基因表达
检测蛋白表达
检测蛋白定位
肠道菌群分析

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Sigma--
胎牛血清Sigma--
链霉素和青霉素Sigma--
脂多糖----
三磷酸腺苷----
温热中药Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd.--
CRID3Amgen--
补肺消积饮Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd.--
生理盐水Solarbio--
小鼠NLRP3 ELISA试剂盒MeimianMM-0656M1
小鼠caspase-1 ELISA试剂盒MeimianMM-0820M1
小鼠pro-IL-1β ELISA试剂盒MeimianMM-0905M1
小鼠pro-IL-18 ELISA试剂盒MeimianMM-0906M1
小鼠IL-1β ELISA试剂盒MeimianMM-0905M1
小鼠IL-18 ELISA试剂盒MeimianMM-0906M1
小鼠MDA ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-0060c
酶标仪(MuLTiSKAN MK3)Thermo Fisher Scientific--
TRIzol试剂TaKaRa Biotechnology Co., Ltd.--
PrimeScript RT试剂盒TakaraRR047A
Bio-Rad ScripTM cDNA合成试剂盒Bio-Rad Laboratories, Inc.--
NLRP3抗体(ab214185)Abcamab214185
ASC抗体(67824s)Cell Signaling Technology, Inc.67824s
IL-1β抗体(2242s)CST2242s
IL-18抗体(ab71495)Abcamab71495
MDA抗体(LS-Bio 188950)LS-BioLS-Bio 188950
pro-caspase-1抗体(ab179515)Abcamab179515
PKC-α抗体(ab32376)Abcamab32376
BCL2L1抗体(A00181)BosterA00181
总蛋白提取试剂盒SolarbioBC3711
蛋白定量试剂盒Beyotime--
PVDF膜Millipore--
牛血清白蛋白Sangon Biotech--
羊抗兔IgG (H+L)-HRPAbcamab6721
ECL化学发光试剂盒EMD MilliporeWBULS0500
PowerSoil@ DNA提取试剂盒Bio-Tek--
Illumina Miseq PE 2500平台Illumina--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞模型
A549细胞培养条件(DMEM+10%FBS+1%双抗,37°C,5%CO2);LPS和ATP处理浓度及时间
阅读提示:见Materials and methods中的Cell culture and drug administration
动物模型
小鼠品系、性别、年龄、体重;气阴两虚模型构建(温药剂量、烟熏时间);肿瘤细胞注射量
阅读提示:见Materials and methods中的Animal和Experimental groups and drug administration
药物干预
BFXJY剂量和给药方式;CRID3剂量;给药时间点
阅读提示:见Materials and methods中的Experimental groups and drug administration
样本收集
麻醉方式;血清和肿瘤组织收集时间;盲肠内容物收集
阅读提示:见Materials and methods中的Experimental groups and drug administration
检测方法
ELISA试剂盒型号;Western blot抗体信息;qRT-PCR引物序列;16S rDNA测序流程
阅读提示:见Materials and methods中的ELISA、Western blot assay、qRT-PCR和Sample DNA extraction and 16S rDNA amplicon sequencing