细胞模型建立与炎症诱导
建立A549细胞炎症模型,以模拟肺癌细胞的炎症环境。
A549细胞以1×10^4/孔接种于96孔板,培养24小时后,用1μg/ml LPS处理6小时,再用5μM ATP处理30分钟诱导炎症。
BuFeiXiaoJiYin ameliorates the NLRP3 inflammation response and gut microbiota in mice with lung cancer companied with Qi-yin deficiency.
实验包含体外细胞诱导、体内动物模型、药物干预及多项检测,但缺乏机制验证的独立性,且部分结果无统计学差异。
A549细胞 BALB/c-nu小鼠肺癌模型 肺癌伴气阴两虚小鼠模型
动物品系:雌性BALB/c-nu小鼠,5-6周龄,18-22g 模型建立:气阴两虚模型(灌胃温药、烟熏30分钟/天,连续10天);肿瘤模型(皮下注射0.2ml 1×10^7/ml A549细胞) 给药:BFXJY低、中、高剂量分别为2.5, 5.0, 10.0 g/kg;阳性对照CRID3 1mg/kg;连续27天 样本量:每组5只小鼠(n=5) 统计:单因素方差分析和Duncan检验,p<0.05为显著
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立A549细胞炎症模型,以模拟肺癌细胞的炎症环境。
A549细胞以1×10^4/孔接种于96孔板,培养24小时后,用1μg/ml LPS处理6小时,再用5μM ATP处理30分钟诱导炎症。
构建肺癌伴气阴两虚小鼠模型,并引入炎症刺激。
雌性BALB/c-nu小鼠,气阴两虚模型(灌胃20g/kg温药,烟熏30分钟/天,连续10天),然后皮下注射0.2ml 1×10^7/ml A549细胞(对照组和单纯气阴两虚组)或经LPS/ATP处理的A549细胞(其余组)。
评估不同剂量BFXJY和阳性对照对模型小鼠的影响。
在移植后第0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27天灌胃给药,阳性组用CRID3 1mg/kg,低、中、高剂量组分别用BFXJY 2.5, 5.0, 10.0 g/kg,对照组给予生理盐水。
监测肿瘤生长,并在实验终点收集血清、肿瘤和盲肠内容物用于后续分析。
在0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27天测量肿瘤体积;第27天处死小鼠,取血、肿瘤组织和盲肠内容物。
检测IL-1β、IL-18等炎症因子和NLRP3炎症小体组分的表达水平。
使用ELISA检测血清IL-1β、IL-18、NLRP3、pro-caspase-1、MDA;Western blot和IHC检测肿瘤组织中IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC、pro-caspase-1;qRT-PCR检测NLRP3和ASC mRNA表达。
分析模型和药物干预后肠道菌群的多样性和组成变化。
盲肠内容物提取DNA,扩增16S rDNA V3-V4区域,Illumina MiSeq测序,进行OTU聚类和多样性分析。
探索BFXJY对PKC信号通路的影响。
通过Western blot和IHC检测PKC-α蛋白表达,ELISA检测MDA水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma | -- |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 链霉素和青霉素 | Sigma | -- | |
| 炎症诱导 | 脂多糖 | -- | -- |
| 三磷酸腺苷 | -- | -- | |
| 动物模型 | 温热中药 | Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd. | -- |
| 药物干预 | CRID3 | Amgen | -- |
| 补肺消积饮 | Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd. | -- | |
| 生理盐水 | Solarbio | -- | |
| ELISA | 小鼠NLRP3 ELISA试剂盒 | Meimian | MM-0656M1 |
| 小鼠caspase-1 ELISA试剂盒 | Meimian | MM-0820M1 | |
| 小鼠pro-IL-1β ELISA试剂盒 | Meimian | MM-0905M1 | |
| 小鼠pro-IL-18 ELISA试剂盒 | Meimian | MM-0906M1 | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Meimian | MM-0905M1 | |
| 小鼠IL-18 ELISA试剂盒 | Meimian | MM-0906M1 | |
| 小鼠MDA ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0060c | |
| 酶标仪(MuLTiSKAN MK3) | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR047A | |
| Bio-Rad ScripTM cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | -- | |
| IHC | NLRP3抗体(ab214185) | Abcam | ab214185 |
| ASC抗体(67824s) | Cell Signaling Technology, Inc. | 67824s | |
| IL-1β抗体(2242s) | CST | 2242s | |
| IL-18抗体(ab71495) | Abcam | ab71495 | |
| MDA抗体(LS-Bio 188950) | LS-Bio | LS-Bio 188950 | |
| pro-caspase-1抗体(ab179515) | Abcam | ab179515 | |
| PKC-α抗体(ab32376) | Abcam | ab32376 | |
| BCL2L1抗体(A00181) | Boster | A00181 | |
| Western blot | 总蛋白提取试剂盒 | Solarbio | BC3711 |
| 蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sangon Biotech | -- | |
| 羊抗兔IgG (H+L)-HRP | Abcam | ab6721 | |
| ECL化学发光试剂盒 | EMD Millipore | WBULS0500 | |
| 16S rDNA测序 | PowerSoil@ DNA提取试剂盒 | Bio-Tek | -- |
| Illumina Miseq PE 2500平台 | Illumina | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型 | A549细胞培养条件(DMEM+10%FBS+1%双抗,37°C,5%CO2);LPS和ATP处理浓度及时间 阅读提示:见Materials and methods中的Cell culture and drug administration |
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、体重;气阴两虚模型构建(温药剂量、烟熏时间);肿瘤细胞注射量 阅读提示:见Materials and methods中的Animal和Experimental groups and drug administration |
| 药物干预 | BFXJY剂量和给药方式;CRID3剂量;给药时间点 阅读提示:见Materials and methods中的Experimental groups and drug administration |
| 样本收集 | 麻醉方式;血清和肿瘤组织收集时间;盲肠内容物收集 阅读提示:见Materials and methods中的Experimental groups and drug administration |
| 检测方法 | ELISA试剂盒型号;Western blot抗体信息;qRT-PCR引物序列;16S rDNA测序流程 阅读提示:见Materials and methods中的ELISA、Western blot assay、qRT-PCR和Sample DNA extraction and 16S rDNA amplicon sequencing |