MoDCs的分离与分化
获取成熟的树突状细胞用于后续实验。
从健康供体外周血中分离PBMCs，用CD14微珠分选CD14+单核细胞，并在IL-4和GM-CSF存在下培养5-7天分化为MoDCs。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
雷公藤红素通过介导树突状细胞中的抗原转运下调α-突触核蛋白特异性T细胞反应
Celastrol Downmodulates Alpha-Synuclein-Specific T Cell Responses by Mediating Antigen Trafficking in Dendritic Cells.
实验完整度
高包含体外细胞模型（MoDCs、BV2）、共培养实验、免疫荧光、Western blot、免疫沉淀等多层级验证，并明确功能与机制验证。
主要模型
人单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs） α-syn特异性CD4+ T细胞共培养体系 小鼠BV2小胶质细胞系
重点核对
MoDCs分离与分化条件（CD14+磁珠、IL-4和GM-CSF） 纤维状α-syn处理浓度（1 µg/ml）及时间（4h、24h等） C1和Celastrol预处理浓度（1 µM和0.25 µM）及时间（1h） 共培养比例（MoDC:T细胞=1:5）及时间（1天、3天） 流式检测T细胞亚群（Th1、Th17、Treg）的标记物
摘要
帕金森病（PD）是一种影响老年人的神经退行性疾病。它与中脑内错误折叠或聚集的纤维状α-突触核蛋白（α-syn）的积累导致的运动功能障碍有关。目前的治疗主要集中于缓解症状，但伴有副作用，并且在阻止疾病进展方面有限。越来越多的证据指出外周免疫细胞是疾病发展的基础，特别是T细胞在PD中与α-syn相关的神经炎症中起作用。这些细胞的起始可能由树突状细胞（DCs）介导，其在α-syn特异性反应中的作用研究较少。此外，源自中药（TCM）的化合物可能是治疗PD的候选药物，可能减轻DC-T细胞介导的免疫反应。因此，我们的研究聚焦于DC在响应纤维状α-syn及随后诱导抗原特异性T细胞反应中的作用，以及中药姜黄素类似物C1和雷公藤红素（Celastrol）的效果。我们发现，尽管纤维状α-syn未诱导显著的炎症或T细胞介导的细胞因子，但将纤维状α-syn预处理的DC与α-syn特异性CD4+ T细胞共培养时，发现了强烈的促炎性T细胞反应。雷公藤红素（而非C1）通过促进内体、双性体和自噬囊泡与纤维状α-syn的相互作用，减少了促炎性T细胞分化的发生，这可能导致其降解，从而减少可用于呈递和T细胞识别的抗原肽。总之，通过DC调节α-syn的细胞内转运/加工可能是控制PD进展的潜在方法，其中雷公藤红素是实现这一目标的潜在候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探讨树突状细胞对纤维状α-synuclein的响应及其诱导α-syn特异性T细胞反应的能力，并评估中药化合物C1和Celastrol的调节作用。
- 核心机制
- Celastrol通过促进α-syn与内体、双性体和自噬囊泡的共定位，增强α-syn的降解，减少可用于抗原呈递的肽段，从而抑制α-syn特异性T细胞分化。
- 主要证据
- 通过共培养实验，α-syn预处理的MoDCs可诱导Th1、Th17和Treg细胞；免疫荧光显示α-syn与Rab5、Rab7、Beclin1、LC3等共定位；Western blot和免疫沉淀显示Celastrol上调Beclin1、LC3-II/LC3-I比值和Rab5-GTP/Rab7-GTP活性。
- 研究意义
- 调节DC中α-syn的胞内转运/加工可能是控制PD进展的潜在策略，Celastrol可作为实现该策略的候选药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
α-syn处理及药物预处理
检测纤维状α-syn对MoDCs的激活作用及C1和Celastrol的调节效应。
MoDCs用C1 (1 µM) 或Celastrol (0.25 µM) 预处理1小时，然后加入纤维状α-syn (1 µg/ml) 处理不同时间（4h、24h等），收集细胞进行后续检测。
MoDCs表面分子和细胞因子基因表达检测
评估α-syn处理对MoDCs抗原呈递分子、共刺激分子和炎症细胞因子表达的影响。
通过流式细胞术检测HLA-ABC、HLA-DR、CD80、CD86的表达；通过qRT-PCR检测IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α、IL-10、TGF-β的基因表达。
共培养实验诱导α-syn特异性CD4+ T细胞
验证α-syn预处理的MoDCs是否能诱导α-syn特异性T细胞分化，并测试C1和Celastrol的调节作用。
将α-syn特异性CD4+ T细胞与α-syn预处理的MoDCs以1:5比例共培养，1天后检测Th1（T-bet+IFN-γ+），3天后检测Th17（RORγt+IL-17A+）和Treg（CD25+FoxP3+）。
免疫荧光检测α-syn与内体/自噬蛋白共定位
确定α-syn在MoDCs中的胞内转运路径及Celastrol的影响。
用激光共聚焦显微镜观察α-syn与Rab5、Rab7、Rab9、Rab11、Rab14、Lamp1、Beclin1、LC3、p62的共定位。
Western blot和免疫沉淀验证蛋白表达和活性
验证Celastrol对自噬相关蛋白表达和Rab GTPase活性的影响。
通过Western blot检测Beclin1、LC3-I/II、p62的表达；通过免疫沉淀检测Rab5-GTP和Rab7-GTP的活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | Lymphoprep密度梯度分离液 | Stemcell Technologies | 07851 |
| 人CD14微珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875-085 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 青霉素-链霉素（10000 U/ml） | Gibco | 15140-122 | |
| 重组人白细胞介素-4 | PeproTech | 200-04 | |
| 重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 300-03 | |
| 药物处理 | 雷公藤红素 | -- | -- |
| C1（姜黄素类似物） | -- | -- | |
| 细胞处理 | 重组人α-突触核蛋白聚集体（活性）（纤维状α-syn） | Abcam | ab218819 |
| qRT-PCR | RNAiso Plus 总RNA提取试剂 | -- | -- |
| PrimeScript™ RT Master Mix逆转录试剂盒 | Takara | RR047A | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNase H Plus) 实时定量PCR试剂 | Takara | RR820A | |
| StepOnePlus™ 实时荧光定量PCR仪 | Invitrogen | 4376600 | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Gibco | 11965-126 |
| 细胞系 | BV2细胞系 | Elabscience | EP-CL-0493 |
| 细胞处理 | 脂多糖 | -- | -- |
| 流式细胞术 | BV421小鼠抗人HLA-ABC抗体 | BD Pharmingen | 565332 |
| APC小鼠抗人HLA-DR抗体 | BD Pharmingen | 560896 | |
| PE-Cy7小鼠抗人CD86抗体 | BD Pharmingen | 561128 | |
| FITC小鼠抗人CD80抗体 | BD Pharmingen | 555683 | |
| BD FACSCanto™ II流式细胞仪 | BD | -- | |
| T细胞培养 | GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050-061 |
| α-syn多肽EQVTNVGGAVVTGVT | ChinaPeptides | -- | |
| 重组人白细胞介素-2 | PeproTech | 200-02 | |
| T细胞分离 | 人CD4+ T细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-533 |
| 流式细胞术 | FITC小鼠抗人CD3抗体 | BD Pharmingen | 555339 |
| V500小鼠抗人CD4抗体 | BD Pharmingen | 560768 | |
| APC-Cy7小鼠抗人CD25抗体 | BD Pharmingen | 557753 | |
| PE-Cy7小鼠抗人IFN-γ抗体 | BD Pharmingen | 557643 | |
| PerCP-Cy5.5小鼠抗人T-bet抗体 | BD Pharmingen | 561316 | |
| Alexa Fluor 647小鼠抗人RORγt抗体 | BD Pharmingen | 563620 | |
| PerCP-Cy5.5小鼠抗人IL-17A抗体 | BD Pharmingen | 560799 | |
| PE小鼠抗人FoxP3抗体 | BD Pharmingen | 560046 | |
| 免疫荧光 | Nunc™ Lab-Tek™ II 8孔腔室盖玻片（1.5硼硅酸盐玻璃） | Invitrogen | 155409 |
| 正常山羊血清 | Invitrogen | 31873 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | 9048-46-8 | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 小鼠抗Rab5抗体 | Abcam | ab66746 | |
| 兔抗Rab14抗体 | Abcam | ab40938 | |
| 小鼠抗Rab7抗体 | Abcam | ab50533 | |
| 兔抗Rab11抗体 | Abcam | ab36112 | |
| 小鼠抗Rab9抗体 | Invitrogen | MA3-067 | |
| 兔抗Lamp1抗体 | Abcam | ab24170 | |
| 鸡抗α-syn抗体 | Arigobio | ARG10689 | |
| 兔抗Beclin1抗体 | Abcam | ab62557 | |
| 小鼠抗SQSTM1/p62抗体 | Abcam | ab56416 | |
| 兔抗LC3B抗体 | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗 | Invitrogen | A27034 | |
| Alexa Fluor 647山羊抗小鼠二抗 | Invitrogen | A28181 | |
| DyLight抗鸡IgY H&L二抗 | Abcam | ab96948 | |
| Hoechst 33258核染色剂 | Abcam | ab228550 | |
| ibidi封片剂 | ibidi | 50001 | |
| Leica TCS SP5共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Western blot | Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 |
| Immobilon®-P聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 | Sigma | P2938 | |
| Mini Trans-Blot电转印槽 | Bio-Rad | -- | |
| 抗β-actin单克隆抗体克隆RM112 | Merck Millipore | MABT523 | |
| HRP标记驴抗兔二抗 | Merck Millipore | AP182P | |
| HRP标记山羊抗小鼠二抗 | Merck Millipore | AP130P | |
| SuperSignal™ West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Scientific | 34580 | |
| SuperSignal™ West Femto最大灵敏度化学发光底物 | Thermo Scientific | 34094 | |
| ChemiDoc凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗Rab5-GTP小鼠单克隆抗体 | NewEast Biosciences | 83701 |
| 抗活化Rab7小鼠单克隆抗体 | NewEast Biosciences | 26923 | |
| 重组蛋白G（HRP标记） | Abcam | ab7460 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MoDC分化 | CD14+单核细胞分离方法（磁珠分选）、分化因子浓度（IL-4和GM-CSF均为25 µg/ml）、培养时间（5-7天）、细胞密度（1×10^6/ml） 阅读提示：见Materials and Methods中的CD14+ Monocytes Isolation and Differentiation Into MoDCs |
| 药物预处理与α-syn刺激 | C1浓度（1 µM）、Celastrol浓度（0.25 µM）、预处理时间（1小时）、α-syn浓度（1 µg/ml）、处理时间（不同实验不同，如qRT-PCR 4小时，流式24小时，免疫荧光15/30/60分钟、4/6/16小时） 阅读提示：见Materials and Methods中的qRT-PCR、Flow Cytometry、Immunofluorescence等及Figure legends |
| 共培养实验 | α-syn特异性T细胞的生成（多肽序列EQVTNVGGAVVTGVT 5 µg/ml、IL-2浓度、再刺激方案）、共培养比例（1:5）、共培养时间（1天和3天）、检测的T细胞亚群标志物 阅读提示：见Materials and Methods中的MoDC Stimulation of Antigen-Specific CD4+ T Cells |
| 免疫荧光分析 | 抗体浓度（Rab5 1:200、Rab7 1:500、Rab9 1:500、Rab11 1:500、Rab14 1:200、Lamp1 1:300、Beclin1 1:200、LC3B 1:300、p62 1:200、α-syn 1:1000）、固定和透化条件、共定位分析软件（ImageJ） 阅读提示：见Materials and Methods中的Immunofluorescence Analysis of Rab and Autophagy-Related Proteins Using Confocal Microscopy |
| Western blot和免疫沉淀 | 裂解液成分、蛋白上样量、抗体稀释度（一抗1:500-1:1000、二抗1:10000）、化学发光底物选择、免疫沉淀抗体量（1 µg）和孵育时间（2小时） 阅读提示：见Materials and Methods中的Western Blot和Immunoprecipitation |