构建高糖诱导的HMC DN细胞模型
在体外模拟糖尿病肾病环境，验证HG对HMC增殖、纤维化和氧化应激的影响。
HMC在含有25 mM HG的DMEM培养基中培养48小时，以NG（5 mM）作为对照。随后通过CCK8、EDU染色、Western blot和氧化应激检测评估细胞的增殖、纤维化标志物表达以及ROS、MDA和SOD水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
LncRNA HOTAIR通过调控miR-147a/WNT2B轴促进高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖、纤维化和氧化应激在糖尿病肾病中的作用
LncRNA HOTAIR facilitates high glucose-induced mesangial cell proliferation, fibrosis and oxidative stress in diabetic nephropathy via regulating miR-147a/WNT2B axis.
实验完整度
中该研究包括体外细胞模型、功能获得和功能丧失实验以及机制验证（双荧光素酶报告基因和RIP），但没有动物实验或患者样本验证。
主要模型
高糖诱导的人肾小球系膜细胞（HMC） 293T细胞（用于双荧光素酶报告基因实验）
重点核对
细胞系：HMC（BeNa Culture Collection）和293T 高糖浓度：25 mM HG处理48小时 转染试剂：Lipofectamine 3000 质粒和siRNA：si-lncRNA HOTAIR、miR-147a mimic/inhibitor、pcDNA-WNT2B等 检测指标：细胞活力（CCK8）、增殖（EDU）、蛋白表达（Western blot）、氧化应激（ROS、MDA、SOD）
摘要
背景：长链非编码RNA（lncRNAs）已被证明参与许多疾病的进展调控。然而，lncRNA HOX转录反义RNA（HOTAIR）在糖尿病肾病（DN）中的作用仍不清楚。方法：采用高糖（HG）诱导的人肾小球系膜细胞（HMC）构建DN体外细胞模型。通过CCK8实验和EDU染色评估HMC增殖。使用western blot分析检测增殖标志物、纤维化标志物和wingless-type家族成员2B（WNT2B）的蛋白水平。通过测定活性氧和丙二醛水平以及超氧化物歧化酶活性评估HMC氧化应激。使用定量实时PCR检测lncRNA HOTAIR、microRNA（miR）-147a和WNT2B的相对表达水平。通过双荧光素酶报告基因实验和RIP实验确认miR-147a与lncRNA HOTAIR或WNT2B之间的相互作用。结果：我们的数据表明，lncRNA HOTAIR敲低可抑制HG诱导的HMC的增殖、纤维化和氧化应激。LncRNA HOTAIR可作为miR-147a的海绵。miR-147a抑制剂可逆转lncRNA HOTAIR沉默对HG诱导的HMC生物学功能的抑制作用。WNT2B是miR-147a的靶标，其过表达也逆转了miR-147a对HG诱导的HMC增殖、纤维化和氧化应激的抑制作用。结论：总之，我们的研究指出，lncRNA HOTAIR可通过介导miR-147a/WNT2B轴促进DN进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- lncRNA HOTAIR在糖尿病肾病进展中是否发挥作用，以及其潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- lncRNA HOTAIR作为miR-147a的海绵，抑制miR-147a的表达，从而上调其靶基因WNT2B，进而促进HG诱导的HMC增殖、纤维化和氧化应激。
- 主要证据
- 在HG诱导的HMC中，lncRNA HOTAIR表达上调；敲低lncRNA HOTAIR抑制细胞增殖、纤维化和氧化应激；miR-147a抑制剂或WNT2B过表达可逆转该抑制作用；双荧光素酶报告基因和RIP实验验证了lncRNA HOTAIR-miR-147a和miR-147a-WNT2B的直接相互作用。
- 研究意义
- 揭示了lncRNA HOTAIR在DN进展中的作用，提示lncRNA HOTAIR可能成为DN治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
敲低lncRNA HOTAIR并评估其对HG诱导HMC功能的影响
探究lncRNA HOTAIR在HG诱导HMC增殖、纤维化和氧化应激中的作用。
使用si-lncRNA HOTAIR转染HMC，然后进行HG处理。通过CCK8、EDU染色、Western blot和氧化应激检测评估细胞增殖、纤维化标志物（fibronectin、collagen I、α-SMA）和氧化应激水平。
验证lncRNA HOTAIR与miR-147a的相互作用
确认lncRNA HOTAIR是否作为miR-147a的海绵分子。
使用Lncbase2.0软件预测结合位点，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-147a mimic对lncRNA HOTAIR wt/mut载体荧光素酶活性的影响，并通过RIP实验检测Ago2沉淀中lncRNA HOTAIR和miR-147a的富集。同时检测si-lncRNA HOTAIR对miR-147a表达的影响以及HG处理下miR-147a的表达变化。
miR-147a inhibitor rescue实验
验证lncRNA HOTAIR对HG诱导HMC功能的影响是否依赖于miR-147a。
将si-lncRNA HOTAIR与miR-147a inhibitor共转染HMC，然后进行HG处理。检测miR-147a表达、细胞活力（CCK8）、增殖（EDU）、蛋白表达（PCNA、CyclinD1、fibronectin、collagen I、α-SMA）和氧化应激（ROS、MDA、SOD）。
验证miR-147a的靶基因WNT2B
确认miR-147a是否直接靶向WNT2B。
使用Starbase3.0软件预测结合位点，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-147a mimic对WNT2B 3'UTR wt/mut载体荧光素酶活性的影响，并通过qRT-PCR和Western blot检测HG处理下HMC中WNT2B的mRNA和蛋白表达水平。
WNT2B过表达rescue实验
验证miR-147a对HG诱导HMC功能的影响是否通过靶向WNT2B介导。
将miR-147a mimic与pcDNA-WNT2B共转染HMC，然后进行HG处理。通过qRT-PCR和Western blot验证WNT2B表达，并检测细胞活力（CCK8）、增殖（EDU）、蛋白表达（PCNA、CyclinD1、fibronectin、collagen I、α-SMA）和氧化应激（ROS、MDA、SOD）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证氧化应激
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂 | Dojindo | -- |
| EDU细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Elabscience | -- |
| BCA蛋白浓度检测试剂盒 | Elabscience | -- | |
| PVDF膜 | Roche | -- | |
| Western化学发光HRP底物 | Millipore | -- | |
| 抗PCNA抗体 | Abcam | ab18197 | |
| 抗CyclinD1抗体 | Abcam | ab226977 | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Abcam | ab2413 | |
| 抗I型胶原抗体 | Abcam | ab34710 | |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 抗WNT2B抗体 | Abcam | ab203225 | |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 山羊抗兔IgG | Abcam | ab205718 | |
| 氧化应激检测 | 细胞活性氧检测试剂盒 | Abcam | -- |
| 丙二醛检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 超氧化物歧化酶检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| TaqMan逆转录试剂 | Invitrogen | -- | |
| miScript II逆转录试剂盒 | Qiagen | -- | |
| SYBR Green | Takara | -- | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶分析试剂盒 | Beyotime | -- |
| RIP实验 | Magna RIP试剂盒 | Millipore | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7.0 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与DN模型构建 | HMC细胞系来源（BeNa Culture Collection）；高糖浓度（25 mM）和处理时间（48小时）；正常糖浓度（5 mM）作为对照 阅读提示：参见Materials and methods中Cell culture, treatment and transfection部分 |
| 转染实验 | 转染试剂（Lipofectamine 3000）；siRNA、mimic、inhibitor和过表达质粒序列及浓度；细胞密度（60%） 阅读提示：参见Materials and methods中Cell culture, treatment and transfection部分 |
| 细胞增殖检测 | 细胞接种密度（CCK8: 2×10^4 cells/well；EDU: 24孔板）；CCK8孵育时间（4小时）；EDU染色和DAPI染色步骤 阅读提示：参见Materials and methods中CCK8 assay和EDU staining部分 |
| Western blot分析 | 蛋白上样量（20 μg）；抗体稀释比例及货号；内参（β-actin）；封闭液（5%脱脂牛奶） 阅读提示：参见Materials and methods中Western blot部分 |
| 氧化应激检测 | ROS检测试剂盒（Abcam）；MDA和SOD检测试剂盒（Sigma-Aldrich）；检测波长或具体步骤 阅读提示：参见Materials and methods中Detection of oxidative stress部分 |
| qRT-PCR | 引物序列；内参（β-actin或U6）；逆转录试剂盒；SYBR Green；2^-ΔΔCt方法 阅读提示：参见Materials and methods中Quantitative real-time PCR部分 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 报告载体（psiCHECK-2，lncRNA HOTAIR wt/mut和WNT2B 3'UTR wt/mut）；共转染293T细胞；miR-147a mimic或mimic NC；孵育时间（48小时） 阅读提示：参见Materials and methods中Dual-luciferase reporter assay部分 |
| RIP实验 | 抗Ago2和抗IgG抗体；磁珠孵育时间（4小时）；qRT-PCR检测富集 阅读提示：参见Materials and methods中RIP assay部分 |