基因克隆与重组质粒构建
扩增G. parasuis血清13型的lpxC和gmhA基因并构建表达载体。
以CY1201株基因组DNA为模板，PCR扩增lpxC和gmhA基因，克隆至pET-28a载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)。
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应用小鼠模型评估重组LpxC和GmhA作为副猪嗜血杆菌血清13型新型抗原疫苗候选物的研究
Application of mouse model for evaluation of recombinant LpxC and GmhA as novel antigenic vaccine candidates of Glaesserella parasuis serotype 13.
实验完整度
高包含基因克隆、蛋白表达纯化、小鼠免疫攻毒保护实验、全血杀菌试验、ELISA检测抗体和细胞因子、肝载菌量测定等多个独立实验层级，并包含功能验证。
主要模型
小鼠模型（KM小鼠） G. parasuis CY1201株（血清13型） 大肠杆菌BL21(DE3)表达系统
重点核对
免疫剂量：LpxC和GmhA各100μg/100μl，混合组各50μg/100μl 攻毒剂量：3×10^9 CFU（最小致死剂量） 攻毒途径：腹腔注射 免疫途径：皮下注射 观察时间：攻毒后监测两周，每6小时记录
摘要
副猪嗜血杆菌（G. parasuis）一直是影响规模化养猪业的细菌之一。缺乏有效的疫苗限制了对该病的控制，从而影响了其流行。为了提高疫苗的交叉保护力，亚单位疫苗的开发已成为热点。在本研究中，我们首先从副猪嗜血杆菌血清13型分离株中克隆了lpxC和gmhA基因，并表达和纯化了它们的蛋白质。结果表明，LpxC和GmhA能刺激小鼠产生IgG抗体。通过检测白细胞介素4（IL-4）、IL-10和干扰素-γ（IFN-γ）的细胞因子水平，发现重组GmhA、LpxC和GmhA的混合物能刺激机体产生Th1和Th2免疫应答，而重组LpxC和灭活菌只能产生Th2免疫应答。在小鼠保护率方面，重组LpxC、GmhA以及LpxC和GmhA的混合物分别对致死剂量的G. parasuis感染提供50%、50%和60%的保护。重组LpxC和GmhA获得的这部分保护支持它们作为抗G. parasuis新型疫苗候选抗原的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估重组蛋白LpxC和GmhA作为副猪嗜血杆菌血清13型亚单位疫苗候选抗原的免疫保护效果。
- 核心机制
- 重组GmhA及LpxC+GmhA混合物可诱导Th1和Th2免疫应答，而重组LpxC和灭活菌仅诱导Th2免疫应答，通过抗体介导的杀菌作用提供部分保护。
- 主要证据
- 小鼠模型中，重组LpxC、GmhA和混合蛋白分别提供50%、50%和60%的保护率，且全血杀菌试验显示杀菌率显著高于阴性对照组（P<0.01）。
- 研究意义
- 研究首次在鼠模型中评价了这两种蛋白对G. parasuis的保护作用，表明它们可作为抗G. parasuis感染的候选疫苗，为进一步研究其对剖腹产及断奶仔猪的免疫保护效果奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重组蛋白表达与纯化
表达并纯化重组His-tagged LpxC和GmhA蛋白。
将含重组质粒的E. coli BL21(DE3)在LB培养基中培养，IPTG诱导表达，超声裂解，Ni-NTA亲和纯化，并通过SDS-PAGE和Western Blot鉴定。
小鼠免疫与攻毒实验
评估重组蛋白对小鼠的免疫原性和保护效果。
70只KM雌性小鼠随机分为7组，每组10只，皮下注射免疫，二次免疫后两周进行攻毒，观察存活率和临床症状。
全血杀菌试验
验证免疫后血清是否具有抗体介导的杀菌活性。
将免疫小鼠血清与细菌混合，加入未免疫小鼠肝素抗凝血培养，涂布TSA平板计数，计算杀菌率。
ELISA检测抗体和细胞因子水平
检测免疫后小鼠血清IgG抗体和细胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-10）水平。
使用间接ELISA检测IgG，使用商品化ELISA试剂盒检测细胞因子浓度。
肝载菌量测定
评估免疫攻毒后小鼠肝脏中G. parasuis的清除情况。
取攻毒后死亡或存活小鼠肝脏，称重、研磨、稀释涂板计数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 胰蛋白胨大豆琼脂 | Solarbio | -- |
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | Solarbio | -- | |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | Solarbio | -- | |
| Luria-Bertani培养基 | Solarbio | -- | |
| 基因克隆 | 细菌基因组DNA提取试剂盒 | TaKaRa | -- |
| T4 DNA连接酶 | TaKaRa | -- | |
| 蛋白表达 | 异丙基硫代半乳糖苷 | Sangon Biotech | -- |
| 蛋白纯化 | 镍氮三乙酸亲和色谱 | -- | -- |
| Western blot | 小鼠抗His抗体 | TransGen Biotech | -- |
| 兔抗副猪嗜血杆菌血清 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Sigma | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Sigma | -- | |
| ECL发光液 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 免疫实验 | 弗氏佐剂 | Sigma | -- |
| ELISA | 酶标仪 | Bio-Rad | -- |
| TMB底物 | -- | -- | |
| 小鼠IL-4 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 小鼠IL-10 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养 | 培养基成分、NAD浓度、血清浓度、培养温度需一致 阅读提示：Materials and Methods: Bacterial strains and growth conditions |
| 基因克隆 | PCR退火温度、限制性酶切位点、连接温度和时间 阅读提示：Materials and Methods: Construction of recombinant plasmids |
| 蛋白表达与纯化 | IPTG浓度、诱导温度和时间、超声裂解条件、纯化柱 阅读提示：Materials and Methods: Expression and purification of immunogenic proteins |
| 小鼠免疫与攻毒 | 小鼠品系、性别、周龄或体重、分组、免疫剂量、佐剂类型、免疫途径、攻毒剂量和途径、观察时间 阅读提示：Materials and Methods: Immunization and challenge experiments in mice |
| 全血杀菌试验 | 血清灭活温度和时间、细菌浓度、培养时间、稀释倍数 阅读提示：Materials and Methods: Whole blood sterilization test |
| ELISA检测 | 包被抗原浓度、血清稀释度、二抗稀释度、孵育时间和温度 阅读提示：Materials and Methods: Determination of IgG level by ELISA; Determination of cytokines by ELISA assay |
| 肝载菌量 | 肝脏研磨方法、稀释倍数、培养时间 阅读提示：Materials and Methods: Determination of bacterial load in mice liver |
| 统计 | 统计方法和显著性水平 阅读提示：Materials and Methods: Statistical analysis |