激活自然杀伤细胞受体、选择素和抑制性Siglecs识别埃博拉病毒糖蛋白

Activating Natural Killer Cell Receptors, Selectins, and Inhibitory Siglecs Recognize Ebolavirus Glycoprotein.

作者信息Mostafa Jarahian, Katharina Marstaller, Nadine Banna, Roshanak Ahani, Mohammad Hossein Etemadzadeh, Lea K Boller, Kayhan Azadmanesh, Angel Cid-Arregui, Abdolrahman Khezri, Martin R Berger, Frank Momburg, Carsten Watzl
PMID34425576
发布时间2022
DOI10.1159/000517628

实验完整度

包含ELISA、流式、酶处理、假病毒结合实验及NK杀伤实验等多层次验证,但缺乏体内模型或患者样本验证。

主要模型

HEK-293 EBOV-GP稳定转染细胞 CHO-K1 EBOV-GP稳定转染细胞 EBOV-GP假型慢病毒颗粒

重点核对

靶细胞为EBOV-GP转染的HEK-293或CHO-K1细胞,对照为空载体转染 重组融合蛋白(NKp44-Fc、NKp46-Fc、选择素-Fc等)浓度2 μg/孔(ELISA)或1-2 μg/染色(流式) NK杀伤实验效应细胞为多克隆NK细胞,效靶比梯度,孵育4小时 酶处理条件:肝素酶I/III(100 mU/100 μL)或神经氨酸酶(5 mU/100 μL)处理1小时 统计:p<0.05为显著,实验重复至少两次或三次

摘要

表达广泛糖基化的埃博拉病毒糖蛋白(EBOV-GP)诱导表面分子的物理改变,并在病毒致病性中起关键作用。在此,我们使用纯化的EBOV-GP、EBOV-GP转染的细胞系以及EBOV-GP假型慢病毒颗粒研究EBOV-GP与宿主表面分子的相互作用。随后,我们希望通过与转染EBOV-GP的细胞的结合研究以及重组可溶性EBOV-GP的结合研究来检查哪些受体参与这种识别。由于病毒成分也可以结合免疫细胞的抑制性受体(例如Siglecs、TIM-1),它们甚至可以抑制免疫效应细胞的活性。我们的数据表明,自然杀伤(NK)细胞受体NKp44和NKp46、选择素(CD62E/P/L)、宿主因子DC-SIGNR/DC-SIGN以及抑制性Siglecs作为EBOV-GP的受体发挥作用。我们的结果还表明,归巢受体(P-、L-和E-选择素)和DC-SIGNR/DC-SIGN对纯化的EBOV-GP、转染EBOV-GP的细胞以及携带EBOV-GP的假型慢病毒载体的包膜具有中度至强烈的亲合力。免疫系统的同时激活和抑制体现了免疫系统与病原体之间的进化拮抗作用。总而言之,这些与激活性和抑制性受体的相互作用导致EBOV-GP表达细胞的NK细胞介导的裂解减少。调节这些相互作用可能为治疗该病毒引起的感染提供新策略。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
EBOV-GP是否能被宿主细胞表面的激活性和抑制性受体识别,以及这些相互作用对NK细胞功能的影响。
核心机制
EBOV-GP通过与NKp44、NKp46等激活受体以及Siglec-5、Siglec-7等抑制性受体结合,并可能通过顺式相互作用掩盖配体,降低NKG2D配体可用性,导致NK细胞激活减少,从而降低对表达EBOV-GP靶细胞的杀伤。
主要证据
ELISA和流式细胞术表明NKp44-Fc、NKp46-Fc、L-选择素-Fc、P-选择素-Fc、Siglec-7-Fc和Siglec-5-Fc与纯化EBOV-GP和EBOV-GP转染细胞结合;酶处理实验显示结合依赖硫酸肝素和唾液酸;51Cr释放实验证明EBOV-GP表达细胞对NK细胞裂解抵抗力增强。
研究意义
揭示了EBOV-GP通过同时激活和抑制免疫受体导致NK细胞功能抑制的免疫逃逸机制,为开发针对埃博拉病毒感染的免疫治疗策略提供了新靶点,例如重定向抗GP抗体的神经氨酸酶活性以减少唾液酸化。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

验证EBOV-GP与重组蛋白的结合

确定EBOV-GP是否能与各种宿主表面受体(包括NK细胞受体、选择素和Siglecs)结合

将纯化的EBOV-GP包被ELISA板,加入各种Fc融合蛋白(如NKp44-Fc、NKp46-Fc等),检测结合活性。

2

在细胞水平验证结合

确认EBOV-GP在细胞表面表达时与受体的结合

使用EBOV-GP稳定转染的HEK-293和CHO-K1细胞,通过流式细胞术检测Fc融合蛋白的结合。

3

评估糖修饰对结合的影响

探究硫酸肝素和唾液酸在受体结合中的作用

用肝素酶I/III和神经氨酸酶处理EBOV-GP转染的CHO-K1细胞,然后检测Fc融合蛋白的结合变化。

4

验证与EBOV-GP假型慢病毒颗粒的结合

在病毒颗粒水平确认EBOV-GP与受体的结合

将EBOV-GP假型慢病毒颗粒包被ELISA板,检测Fc融合蛋白的结合。

5

检测EBOV-GP对NK细胞杀伤的影响

评估EBOV-GP表达是否影响NK细胞对靶细胞的裂解

将EBOV-GP转染的HEK-293细胞或对照细胞作为靶细胞,与多克隆NK细胞共孵育,进行51Cr释放实验。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI 1640培养基Invitrogen--
Iscove改良Dulbecco培养基Invitrogen--
胎牛血清----
人血清----
青霉素-链霉素----
白细胞介素-2NIH Cytokine Repository--
白细胞介素-21Miltenyi Biotec--
白细胞介素-15PAN Biotech--
NK细胞阴性分选试剂盒Miltenyi--
Lipofectamine 2000转染试剂Invitrogen--
遗传霉素(G418)----
杀稻瘟菌素----
pCAGGS-ZEBOV-GP表达质粒----
pcDNA3.1(+)载体Invitrogen--
pcDNA6/V5-His-A/ZEBOV-GP表达质粒----
MicroTest III ELISA板BD Biosciences--
脱脂奶粉Merck--
吐温20Sigma-Aldrich--
牛血清白蛋白----
Pierce无蛋白封闭缓冲液Thermo Scientific--
辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG-Fc抗体Dianova--
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG-Fc抗体Dianova--
Titertek Multiscan plus MKII酶标仪MP Biomedicals--
碘化丙啶Sigma-Aldrich--
FACS Canto II流式细胞仪Becton Dickinson--
FACS LSR Fortessa流式细胞仪Becton Dickinson--
肝素酶I和IIISigma/Aldrich--
α2-3,6,8,9-神经氨酸酶Merck/Calbiochem--
Turbofect转染试剂Thermo Fisher Scientific--
pLOX-CWgfp慢病毒载体----
psPAX2包装质粒----
抗p24抗体----
生物素化抗p24抗体----
辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素----
Bio-Rad分光光度计Bio-Rad--
Nunc Maxisorp微孔板Nunc--
BioTek Synergy 4多功能微孔板检测仪BioTek--
铬-51放射性同位素Hartmann & Braun--
K562-mbIL15-41BBL细胞----
Triton X-100----
96孔F底平板----
γ计数器----
NKp44-Fc融合蛋白R&D2249-NK-05
NKp46-Fc融合蛋白R&D1859-NK-025
NKp30-Fc融合蛋白R&D1849-NK-025
DC-SIGN-Fc/CD209-Fc融合蛋白R&D161-DC-050
DC-SIGNR-Fc/CD299-Fc融合蛋白R&D162-D2-050
Siglec-2-Fc融合蛋白R&D1968-SL-050
Siglec-3-Fc融合蛋白R&D1137-SL-050
Siglec-4-Fc融合蛋白R&D8940-MG-050
Siglec-5-Fc融合蛋白R&D1072-SL-050
Siglec-7-Fc融合蛋白R&D1138-SL-050
Siglec-10-Fc融合蛋白R&D2130-SL-050
PSGL-1-Fc融合蛋白R&D3345-PS-050
NKG2D-Fc融合蛋白R&D1299-NK-050
E-选择素-Fc融合蛋白R&DADP1-050
P-选择素-Fc融合蛋白R&D137-LS-050
L-选择素-Fc融合蛋白R&D728-LS-100
TIM-1-Fc融合蛋白R&D9319-TM-100
CD44-Fc融合蛋白R&D3360-CD-050
CD24-Fc融合蛋白R&D5247-CD-050
Syndecan 1-Fc融合蛋白ElabsciencePKSH033514

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与转染
HEK-293和CHO-K1细胞的培养条件(培养基、血清、添加物);转染质粒(pCAGGS-ZEBOV-GP或pcDNA6/V5-His-A/ZEBOV-GP)和转染试剂(Lipofectamine 2000);选择抗生素浓度(遗传霉素1 mg/mL或杀稻瘟菌素10 μg/mL);维持浓度(0.5 mg/mL或5 μg/mL)
阅读提示:Materials and Methods: Cell Lines, Transfections
ELISA结合实验
EBOV-GP包被浓度(未明确)、包被缓冲液(0.05 M NaHCO3-Na2CO3, pH 9.6)、封闭液(3%脱脂牛奶或Pierce无蛋白封闭液)、Fc融合蛋白浓度(2 μg/孔)、孵育时间(1小时)、洗涤步骤
阅读提示:Materials and Methods: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; Figure 1 legend
流式细胞术分析
细胞数量(0.5-1×10^6)、Fc融合蛋白用量(1-2 μg/染色)、孵育时间(60分钟)、二抗(PE标记抗人IgG-Fc)稀释度(1:100)
阅读提示:Materials and Methods: Flow Cytometry; Figure 2 legend
酶处理
肝素酶I/III浓度(100 mU/100 μL)、神经氨酸酶浓度(5 mU/100 μL)、处理时间(1小时)、温度(37°C)
阅读提示:Materials and Methods: Heparanase and Neuraminidase Treatment of Cells; Figure 3 legend
假型慢病毒颗粒
转染质粒比例(3:2)、转染试剂(Turbofect)、病毒收获时间(72小时)、浓缩条件(48,000 g, 3小时)
阅读提示:Materials and Methods: P24 Antigen Capture Assay, ELISA (Lenti-EBOV-GP); Figure 4 legend
NK细胞杀伤实验
NK细胞分离方法(阴性分选)、扩增条件(IL-2, IL-15, IL-21)、靶细胞标记(51Cr, 100 μCi, 1小时)、效靶比、孵育时间(4小时)
阅读提示:Materials and Methods: Chromium Release Assay; Figure 5 legend
统计分析
重复次数(至少2次)、显著性检验(非配对t检验,双侧,p<0.05)
阅读提示:Materials and Methods: Statistical Analysis