构建表达载体和筛选重组菌株
获得能分泌表达NK-Bs的重组毕赤酵母菌株。
合成经密码子优化的aprN基因，克隆至pHBM905BDM载体，转化毕赤酵母GS115，通过MD平板和BMMY-酪蛋白平板筛选阳性克隆。
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使用毕赤酵母GS115异源表达枯草芽孢杆菌纳豆激酶并评估其溶栓活性
Heterologous expression of nattokinase from B. subtilis natto using Pichia pastoris GS115 and assessment of its thrombolytic activity.
实验完整度
高包含基因构建、蛋白表达、纯化、酶学特性分析、体外纤溶活性以及大鼠微血管血栓模型体内溶栓验证等多层次实验。
主要模型
Pichia pastoris GS115重组菌株 Sprague-Dawley大鼠微血管血栓模型
重点核对
载体的aprN基因拷贝数（1-7拷贝） 甲醇诱导浓度和时间（1%甲醇，48-120小时） κ-卡拉胶诱导大鼠血栓模型的剂量（2.0 mg/mL）和频率 纳豆激酶给药剂量（高50,000 IU/kg、中10,000 IU/kg、低2,000 IU/kg） 血栓评估指标（FDP和D-dimer水平）
摘要
背景：纳豆激酶是一种纤维蛋白溶解酶，作为促进健康的营养补充剂具有巨大的市场价值。为提高纳豆激酶产量，已优化了发酵条件、菌株、培养基和补料策略。纳豆激酶已通过多种异源表达系统进行表达。毕赤酵母异源表达系统是一种替代方案。结果：本报告旨在使用毕赤酵母异源表达系统高水平表达来自枯草芽孢杆菌纳豆的纳豆激酶（NK-Bs），并评估其体内纤溶活性。构建了含有1-7个aprN基因拷贝的多拷贝表达菌株。目标蛋白的表达水平在五个拷贝时达到最高。然而，多拷贝表达菌株在摇瓶或高密度发酵中不稳定，导致批间目标蛋白产量存在显著差异。因此，使用含有单拷贝aprN的毕赤酵母进行摇瓶和高密度发酵。摇瓶发酵中目标蛋白产量为320 mg/L，高密度发酵中约为9.5 g/L。重组纳豆激酶表现出较高的热稳定性和pH稳定性。本研究还证明，重组NK-Bs具有明显的溶栓活性。结论：本研究表明，毕赤酵母表达系统是低成本大规模制备纳豆激酶的理想平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 利用毕赤酵母GS115系统能否高水平表达枯草芽孢杆菌纳豆激酶，且重组蛋白是否具有溶栓活性？
- 核心机制
- 重组纳豆激酶通过直接降解交联纤维蛋白以及可能通过激活纤溶系统发挥溶栓作用；其活性依赖于丝氨酸蛋白酶催化中心残基（D32、H64、S221）。
- 主要证据
- 构建了含有不同拷贝数aprN基因的重组菌株，摇瓶和高密度发酵获得高产量（320 mg/L和9.5 g/L）；纤维蛋白平板实验显示纤溶活性；大鼠血栓模型显示FDP和D-dimer水平升高，组织病理显示血栓减少。
- 研究意义
- 该研究为纳豆激酶的大规模、低成本制备提供了理想平台，重组纳豆激酶可应用于健康促进。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建多拷贝表达菌株
提高目标蛋白表达量，并考察基因拷贝数对产量的影响。
利用Biobrick组装构建携带2-7个表达盒的载体，转化后通过平板透明圈和SDS-PAGE评估表达水平。
摇瓶发酵表达NK-Bs
评估单拷贝菌株在摇瓶中的表达水平和稳定性。
使用NK-Bs-1菌株进行摇瓶发酵，甲醇诱导，定期取样检测OD600、蛋白浓度和酶活。
高密度发酵表达NK-Bs
放大生产，获得高产量目标蛋白。
采用补料分批发酵，在5L发酵罐中进行，甘油和甲醇补料，控制pH、DO和温度。
NK-Bs的纯化和特性分析
研究重组蛋白的酶学性质。
通过Ni-NTA亲和层析纯化，并用SDS-PAGE分析；检测最适pH、最适温度、pH稳定性、热稳定性以及化学试剂和金属离子的影响。
体外溶栓活性分析
验证重组NK-Bs是否具有纤溶活性。
使用纤维蛋白平板法，观察样品周围透明圈的形成。
大鼠微血管血栓模型评估体内溶栓效果
评估重组NK-Bs在体内的溶栓作用。
使用κ-卡拉胶诱导大鼠尾部血栓模型，不同剂量NK-Bs治疗，检测FDP和D-dimer水平以及耳组织病理学。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
分子克隆与基因构建
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 菌株与质粒 | 大肠杆菌XL10-Gold | Invitrogen | -- |
| 毕赤酵母GS115 | Invitrogen | -- | |
| pUC57载体 | GenScript | -- | |
| 试剂 | 蚯蚓激酶 | Sigma | -- |
| 纤维蛋白原 | Sigma | -- | |
| 分子克隆 | T4 DNA聚合酶 | TaKaRa | -- |
| T4连接酶 | TaKaRa | -- | |
| 电转化 | Life Technologies Cell-Porator电穿孔仪 | Life Technologies | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA亲和层析 | -- | -- |
| Millipore 10-kDa截留膜 | Millipore | -- | |
| 高密度发酵 | 5L发酵罐 | BaoXing | -- |
| 体外溶栓活性分析 | 牛凝血酶 | -- | -- |
| 体内动物实验 | κ-卡拉胶 | -- | -- |
| ELISA检测 | ABC-ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | -- |
| 组织学检查 | 正置光学显微镜 | Nikon | Eclipse E100 |
| Nikon DS-U3相机 | Nikon | DS-U3 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组菌株构建与筛选 | aprN基因拷贝数（1-7）；电转化参数（7000 V/cm, 25 μF, 400 Ω）；酪蛋白筛选浓度（1%（w/v）） 阅读提示：见Methods：Design and synthesis of the truncated NK-Bs-encoding open reading frame、Construction of recombinant vectors、Screening of recombinant yeast strains |
| 摇瓶发酵 | BMGY培养时间（2天）；BMMY诱导时甲醇浓度（1% v/v）及添加频率；诱导时间（120小时）；离心条件（4000×g, 5 min） 阅读提示：见Methods：Expression of recombinant NK-Bs using shake-flask fermentation |
| 高密度发酵 | 初始pH（5.8）、温度（28°C）、DO（30%）；甘油补料速率（12 mL/h/L）、甲醇补料速率（逐步增加至7 mL/h/L）；诱导时OD600约300；pH和温度调整至5.0和25°C 阅读提示：见Methods：Expression of recombinant NK-Bs using high-density fermentation |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA柱规格（1 mL）；洗脱缓冲液成分（50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 200 mM imidazole, pH8.0） 阅读提示：见Methods：Purification of the target protein |
| 酶学特性分析 | 最适pH测定缓冲液；最适温度范围（50-80°C）；pH稳定性实验（pH2-13, 60 min）；热稳定性实验（50-75°C） 阅读提示：见Methods：Analysis of the characteristics of NK-Bs |
| 体外溶栓活性 | 纤维蛋白平板制备（琼脂糖浓度0.5%、凝血酶1 mg/mL、纤维蛋白原1%）；孵育时间和温度（37°C, 18 h） 阅读提示：见Methods：Analysis of the fibrinolytic activity of NK-Bs in vitro |
| 体内溶栓实验 | 大鼠品系和体重（雌性SD，180-220 g）；κ-卡拉胶浓度和注射方式（皮下注射2.0 mg/mL）；给药剂量（高50,000 IU/kg、中10,000 IU/kg、低2,000 IU/kg）和频率（每12小时，共48小时）；阳性对照（蚯蚓激酶10,000 IU/kg）；每组动物数（5只） 阅读提示：见Methods：Analysis of the fibrinolytic effect of NK-Bs in vivo |
| ELISA检测 | 采血时间（给药后12小时）；抗凝剂（0.2 mL 0.109 mol/L柠檬酸钠）；离心条件（4000×g, 15 min）；检测指标（FDP、D-dimer） 阅读提示：见Methods：Analysis of the fibrinolytic effect of NK-Bs in vivo |