Secretions from hypochlorous acid-treated tumor cells delivered in a melittin hydrogel potentiate cancer immunotherapy.
文献包含体外细胞实验、体内动物模型、功能验证（细胞毒性、免疫细胞活化）及机制验证（TBK1/IRF3磷酸化），证据层级完整。
B16-F10黑色素瘤细胞 B16-LUC黑色素瘤细胞 C57BL/6小鼠皮下黑色素瘤模型
HOCl处理浓度：70 μmol/L，处理4小时，细胞密度8×10^5/mL HOCl-CDS水凝胶制备：10 mg MELR肽溶于1 mL含0.9% NaCl和HOCl-CDS的混合液，4°C过夜 体内治疗剂量：瘤内注射50 μL HOCl-CDS水凝胶（含1 mg MELR和4×10^6 B16-F10细胞/鼠），共3次，间隔3天 抗PD-1联合治疗：腹腔注射100 μg/剂，共4剂，间隔2天 B16-F10接种量：5×10^5细胞/鼠皮下注射
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较不同处理（缺氧、DDP、放疗、PDT、HOCl）对肿瘤细胞CDS的免疫刺激作用的影响。
B16-F10细胞分别进行缺氧（94% N2, 5% CO2, 1% O2，48h）、DDP（40 μmol/L，48h）、放疗（20 Gy）、PDT（1 μg/mL Ce6，12h，660 nm激光1.5 W/cm2，1min，再培养48h）、HOCl（70 μmol/L，4h）处理，收集培养基，离心去碎片，超滤浓缩获得CDS。
筛选出免疫刺激作用最强的CDS类型。
用不同CDS处理BMDCs和BMDMs 24小时，通过流式细胞术检测DC成熟标志（CD80、CD86）和巨噬细胞极化标志（CD86、CD206）。
验证HOCl-CDS水凝胶的形成、微结构、流变学性质及缓释能力。
通过TEM观察水凝胶纳米纤维形貌；流变学测试存储模量G'和损耗模量G''；体内荧光成像评估Dye标记的HOCl-CDS溶液和水凝胶的释放动力学。
验证HOCl-CDS水凝胶对肿瘤细胞的直接杀伤作用及其对DC和巨噬细胞的免疫调节作用。
用CCK-8法检测水凝胶对B16-F10细胞的毒性；用BMDCs和BMDMs检测免疫激活，包括流式细胞术和Western blot检测TBK1/IRF3磷酸化。
验证HOCl-CDS水凝胶在黑色素瘤小鼠模型中的治疗作用及安全性。
B16-F10细胞皮下接种建立肿瘤模型，瘤内注射PBS、MELR水凝胶、HOCl-CDS或HOCl-CDS水凝胶，监测肿瘤生长和生存期；进行血常规、生化分析和组织学检测。
验证HOCl-CDS水凝胶能否促进DC成熟、M1-TAM极化和T细胞浸润。
治疗后第8天，流式细胞术检测淋巴结中mDC比例、肿瘤浸润CD45+细胞、Th1和CTL比例、TAM极化（CD86和CD206）。
验证HOCl-CDS水凝胶是否能增强抗PD-1的治疗效果。
B16-F10荷瘤小鼠分别用PBS、抗PD-1、HOCl-CDS水凝胶、抗PD-1+HOCl-CDS水凝胶处理，监测肿瘤生长和肿瘤重量，流式检测肿瘤内Th1和CTL比例。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 材料合成 | RADA24-蜂毒肽融合肽 | Bankpeptide Ltd. | -- |
| RADA24肽 | Bankpeptide Ltd. | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| CDS制备 | Hank's平衡盐溶液 | -- | -- |
| Amicon Ultra-15超滤离心管 | Millipore | -- | |
| 顺铂 | Sigma | -- | |
| Ce6光敏剂 | -- | -- | |
| 水凝胶表征 | 磷钨酸 | -- | -- |
| 细胞活力 | CCK-8试剂盒 | Biosharp | BS350B |
| 溶血试验 | Triton X-100 | -- | -- |
| 细胞培养 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 白细胞介素-4 | PeproTech | -- | |
| 白细胞介素-13 | PeproTech | -- | |
| ATP检测 | 增强型ATP检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| ELISA | HMGB-1 ELISA试剂盒 | CUSABIO | E08225 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0049c | |
| IL-1α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0036c | |
| GM-CSF ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0032c | |
| M-CSF ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M2445c | |
| MIP-3α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0013c | |
| MIP-1α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0007c | |
| ENA78 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone | SEA860Mu | |
| CD40L ELISA试剂盒 | Cloud-Clone | SEA119Mu | |
| MCP-1 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3001 | |
| IL-12/p70 ELISA试剂盒 | CUSABIO | E04600 | |
| IL-2 ELISA试剂盒 | CUSABIO | E04627 | |
| TGF-β1 ELISA试剂盒 | CUSABIO | E04726 | |
| PGE2 ELISA试剂盒 | CUSABIO | E07966 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | CUSABIO | E04639 | |
| RT-PCR | MicroElute总RNA提取试剂盒 | OMEGA | R6831-01 |
| HiScript III RT SuperMix用于qPCR（+gDNA wiper） | Vazyme | -- | |
| AceQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| 抗p-TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | D52C2 | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3013 | |
| 抗p-IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | D601 | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | D83B9 | |
| NcmECL Ultra化学发光底物 | NCM Biotech | -- | |
| 动物实验 | 抗PD-1抗体 | BioXcell | BE0146 |
| 流式细胞术 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Abcam | -- |
| 莫能菌素钠盐 | Biolegend | -- | |
| 离子霉素 | PeproTech | -- | |
| CD11c抗体 | Biolegend | N418 | |
| CD80抗体 | Biolegend | 16-10A1 | |
| CD86抗体 | Biolegend | GL-1 | |
| CD45抗体 | Biolegend | 30-F11 | |
| CD11b抗体 | Biolegend | M1/70 | |
| F4/80抗体 | Biolegend | BM8 | |
| CD206抗体 | Biolegend | C068C2 | |
| CD3e抗体 | Biolegend | 145-2C11 | |
| CD4抗体 | Biolegend | GK1.5 | |
| CD8a抗体 | Biolegend | 53-6.7 | |
| IFN-γ抗体 | Biolegend | XMG1.2 | |
| 生物发光成像 | 萤火虫荧光素 | Thermo Life | 103404-75-7 |
| 体内释放 | ReadLink™ Rapid iFluor™ 750抗体标记试剂盒 | AAT Bioquest | 1250 |
| 流式细胞术 | GraphPad Prism 7.0 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CDS制备 | HOCl处理浓度、时间、细胞密度；超滤条件（截留分子量3 kDa，离心5000×g 20分钟）；蛋白浓度测定方法 阅读提示：见Methods 2.3节 |
| 水凝胶制备 | MELR肽浓度（10 mg/mL）、溶剂（0.9% NaCl）、孵育温度和时间（4°C过夜） 阅读提示：见Methods 2.4节 |
| 体外免疫刺激实验 | BMDC诱导浓度（GM-CSF 20 ng/mL）、巨噬细胞M2极化条件（IL-4和IL-13 20 ng/mL）、处理时间（24h） 阅读提示：见Methods 2.9节 |
| 体内动物实验 | B16-F10接种量（5×10^5/鼠）、治疗剂量、给药途径和次数、抗PD-1剂量和频率、肿瘤体积测量方法 阅读提示：见Methods 2.14节 |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、刺激条件（PMA、离子霉素、莫能菌素浓度和处理时间）、染色方案 阅读提示：见Methods 2.15节 |
