CST1在PTC组织和细胞系中的表达分析
验证CST1在PTC中的表达水平及其与预后的关系。
使用实时qPCR和western blot检测40对PTC组织和配对正常组织以及PTC细胞系（TPC-1、KTC-1、SW1736）和正常甲状腺上皮细胞系（Nthy-ori3-1）中CST1的表达；通过Kaplan-Meier生存分析评估预后。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
撤回：沉默胱抑素SN消除甲状腺乳头状癌的癌症进展和干细胞特性
Retracted: Silencing of cystatin SN abrogates cancer progression and stem cell properties in papillary thyroid carcinoma.
实验完整度
高包含临床样本表达分析、体外功能获得/缺失实验、体内异种移植模型，以及功能与机制验证。
主要模型
PTC细胞系TPC-1和KTC-1 正常甲状腺上皮细胞系Nthy-ori3-1 异种移植裸鼠模型
重点核对
CST1在PTC组织和细胞中的表达水平（qPCR和Western blot验证） CST1过表达和敲低载体转染效率 CCK-8和集落形成实验检测细胞增殖 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡 体内肿瘤生长监测（体积和重量）
摘要
甲状腺乳头状癌（PTC）约占全球甲状腺癌总数的80%。尽管早期PTC的预后良好，但晚期PTC患者的5年生存率仍然很低。胱抑素SN（cystatin 1，CST1）促进多种癌症的进展，但其在调控PTC发病机制中的作用仍 largely unknown。在本研究中，我们通过实时定量PCR和western blot分析检测了PTC临床组织和细胞系中CST1的表达水平，并进行了功能获得和功能缺失实验，以检查CST1对PTC细胞生长、侵袭、迁移、上皮间质转化和干性的影响。使用体内荷瘤裸鼠模型评估了致瘤性。正如预期，与正常对照相比，PTC组织和细胞中观察到CST1上调（P < 0.05）；此外，CST1水平较高的PTC患者预后不良（P < 0.05）。此外，CST1消融在体内和体外抑制了PTC细胞生长（P < 0.05）。沉默CST1还抑制了PTC细胞的运动性和上皮间质转化（P < 0.05），而CST1过表达对上述细胞功能有相反作用。值得注意的是，CST1上调促进了细胞球体形成（P < 0.05），并增加了PTC细胞中干性标志物的表达水平（P < 0.05）。总之，这些发现表明CST1作为致癌基因促进癌症发展并增强PTC细胞的癌症干细胞特性，增加了我们对PTC发病机制的理解，并可能有助于开发潜在的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CST1在甲状腺乳头状癌进展和干细胞特性中的调控作用是什么？
- 核心机制
- CST1通过促进细胞增殖、运动性、EMT和干性，加速PTC细胞向PTC干细胞转化，从而促进PTC恶性进展。
- 主要证据
- 临床样本中CST1高表达且与不良预后相关；体外实验显示CST1敲低抑制细胞生长、诱导凋亡、抑制迁移和侵袭，过表达则相反；体内异种移植模型显示CST1促进肿瘤生长；干细胞特性相关标志物和球体形成实验证实CST1促进干性。
- 研究意义
- 该研究揭示了CST1作为致癌基因在PTC发病机制中的作用，可能作为PTC诊断和治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CST1对PTC细胞增殖和致瘤性的影响
评估CST1对PTC细胞体外生长和体内肿瘤形成的影响。
构建CST1过表达和敲低载体转染TPC-1和KTC-1细胞，通过CCK-8和集落形成实验检测细胞增殖；通过异种移植裸鼠模型检测肿瘤生长。
CST1对PTC细胞凋亡的影响
检测CST1敲低是否诱导PTC细胞凋亡。
使用锥虫蓝染色评估细胞活力，Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率，western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和Bax的表达。
CST1对PTC细胞侵袭、迁移和EMT的影响
评估CST1对PTC细胞运动性和EMT的影响。
使用Transwell侵袭实验和划痕愈合实验检测细胞侵袭和迁移能力；western blot检测EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin和MMP-9的表达。
CST1对PTC细胞干细胞特性的影响
验证CST1是否调节PTC细胞的干性。
通过实时qPCR和western blot检测干细胞标志物OCT4、SOX2、Nanog和ALDH1的表达，球体形成实验评估自我更新能力，并分析临床样本中CST1与这些标志物的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 达尔伯克改良伊格尔培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 逆转录qPCR试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| qPCR | Power SYBR Green qPCR SuperMix-UDG试剂盒 | Invitrogen | -- |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Gibco | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| 抗CST1抗体 | Abcam | -- | |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | -- | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | Abcam | -- | |
| 抗Bax抗体 | Abcam | -- | |
| 抗N-cadherin抗体 | Abcam | -- | |
| 抗vimentin抗体 | Abcam | -- | |
| 抗OCT4抗体 | Abcam | -- | |
| 抗SOX2抗体 | Abcam | -- | |
| 抗Nanog抗体 | Abcam | -- | |
| 抗ALDH1抗体 | Abcam | -- | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Abcam | Ab6721 | |
| 增强化学发光试剂 | -- | -- | |
| Image Quant LAS 4000C成像系统 | Thermo CE | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | AbMole | -- |
| 细胞凋亡检测 | 凋亡检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology | -- |
| Annexin V-FITC | -- | -- | |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞侵袭检测 | Matrigel基质胶 | Corning Incorporated | -- |
| 细胞迁移检测 | 显微镜 | Olympus | -- |
| 细胞成球实验 | MammoCult培养基 | Stem Cell Technologies | -- |
| 增殖添加剂 | Stem Cell Technologies | -- | |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | Abcam | -- |
| 统计分析 | SPSS 18.0软件 | IBM | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：TPC-1、KTC-1、SW1736和Nthy-ori3-1，培养基DMEM+10%FBS，37°C，5%CO2 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and vectors transfection |
| 基因操作 | CST1过表达载体（LV5-GFP）和siRNA序列（siCST1-#1和#2），转染试剂Lipofectamine RNAiMAX 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and vectors transfection; Table 1 |
| qPCR检测 | RNA提取试剂TRIzol，逆转录试剂盒，引物序列（Table 2），内参β-actin，25μL反应体系 阅读提示：Materials and methods, Real-time qPCR; Table 2 |
| Western blot | 抗体稀释比例（CST1 1:1500, β-actin 1:2000等），二抗（Ab6721 1:2000），蛋白上样量和SDS-PAGE条件 阅读提示：Materials and methods, Western blot analysis |
| 细胞增殖实验 | CCK-8试剂盒，96孔板，450nm吸收值；集落形成实验：6孔板1000细胞/孔，培养2周，结晶紫染色 阅读提示：Materials and methods, Cell Counting Kit-8 assay and Colony formation assay |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI双染，流式细胞仪型号，细胞密度2×10^6/mL 阅读提示：Materials and methods, Annexin V-FITC/PI double-staining assay |
| 侵袭和迁移实验 | Matrigel浓度20μg/well，Transwell小室，24小时；划痕实验：200μL枪头划痕，观察24小时 阅读提示：Materials and methods, Transwell invasion assay and Wound healing assay |
| 成球实验 | MammoCult培养基，添加增殖添加剂，培养10天 阅读提示：Materials and methods, Spheroid formation assay |
| 动物实验 | C57/BL小鼠，每组5只，皮下注射2×10^6细胞，肿瘤体积公式，30天处死 阅读提示：Materials and methods, Xenograft mouse models |