构建假型慢病毒
产生携带SARS-CoV-2刺突蛋白的假型慢病毒颗粒
通过共转染HEK293T细胞，使用HIV-1 NL4-3 ΔEnv ΔVpr Luciferase Reporter Vector和2019-nCov_pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP spike质粒，培养2天后收获上清并过滤。
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基于表达ACE2的CRFK细胞中携带SARS-CoV-2刺突蛋白的假型慢病毒的中和试验
A Neutralization Assay Based on Pseudo-Typed Lentivirus with SARS CoV-2 Spike Protein in ACE2-Expressing CRFK Cells.
实验完整度
中涉及细胞感染、中和抗体滴度测定等明确实验，但未包括体内验证或患者样本的直接验证，主要基于体外细胞实验。
主要模型
ACE2表达的CRFK细胞 HEK293T细胞 VeroE6/TMPRSS2细胞 TZM-bl细胞
重点核对
宿主细胞系：ACE2表达的CRFK细胞，相较HEK293T灵敏度高10倍 假型慢病毒LpVspike(+)的构建：共转染HEK293T细胞，病毒滴度以RLU测定 中和试验中病毒用量：100 TCID50，抗体或血清预孵育后加入细胞 抗体稀释梯度：血清从1:60起始三倍稀释，单抗从10 µg/mL起始三倍稀释 感染后培养时间：48小时，37°C，5% CO2
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是一种传播迅速的高致病性人畜共患病毒。在本研究中，我们改进了现有的中和试验系统，以评估SARS-CoV-2抑制剂，该系统使用携带SARS-CoV-2刺突蛋白的假型慢病毒（LpVspike+）和转染血管紧张素转换酶2（ACE2）的猫Crandell–Rees猫肾（CRFK）细胞作为宿主细胞系。与典型的人胚肾293T（HEK293T）细胞系统相比，该方法灵敏度提高了10倍，并成功应用于定量恢复期抗血清和抗刺突单克隆抗体中和假病毒所需的滴度。两种人恢复期血清SARS-CoV-2免疫球蛋白G（IgG）和SARS-CoV-2免疫球蛋白M（IgM）的50%抑制稀释度（ID50）分别为1:350（±1:20）和1:1250（±1:350）。抗SARS-CoV-2单克隆抗体（mAbs）IgG、IgM和IgA对LpVspike(+)的50%抑制浓度（IC50）分别为0.45（±0.1）、0.002（±0.001）和0.004（±0.001）µg mL−1。我们还发现，通常用于增强感染的试剂在CFRK系统中无效。该方法是高效且安全的；研究人员可将其用于评估中和单克隆抗体，并有助于发现针对SARS-CoV-2的新型抗病毒抑制剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立一种更灵敏、安全的中和试验系统来评估SARS-CoV-2抑制剂和中和抗体？
- 核心机制
- SARS-CoV-2刺突蛋白与宿主细胞ACE2受体的特异性结合是病毒感染的关键，CRFK细胞表达ACE2后对LpVspike(+)的感染具有特异性。
- 主要证据
- 在ACE2表达的CRFK细胞中，LpVspike(+)感染产生较高RLU，而缺乏ACE2的细胞不被感染；中和试验中恢复期血清和单抗能有效抑制病毒感染。
- 研究意义
- 该中和试验系统较传统方法更灵敏、安全，可用于评估中和单克隆抗体和发现新的抗病毒抑制剂，并有助于研究SARS-CoV-2发病机制和疫苗开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生成瞬时ACE2表达细胞系
获得表达ACE2受体的宿主细胞系
将pcDNA3.1+/C-(K) DYK-ACE2质粒转染至各种细胞系（HEK293T、CRFK、Cos7、TZM-bl），孵育1天后用于感染。
比较不同细胞系的感染力
筛选对LpVspike(+)最敏感的细胞系
将LpVspike(+)感染ACE2表达的不同细胞系（Cos7、TZM-bl、CRFK、Vero），并在48小时后测定RLU。
验证刺突蛋白与ACE2的特异性
确认LpVspike(+)感染依赖于ACE2和刺突蛋白
对比LpVspike(+)和LpVspike(−)在CRFK、ACE2-CRFK、HEK293T、ACE2-HEK293T中的感染情况。
测试感染增强剂的影响
评估Deax和polybrene对感染效率的影响
在CRFK和ACE2-CRFK细胞中加入Deax或polybrene，然后感染LpVspike(+)和LpVspike(−)，测定RLU。
中和试验
评估抗体中和SARS-CoV-2假病毒的能力
将LpVspike(+)与不同稀释度的恢复期血清或单克隆抗体预孵育，然后加入ACE2-CRFK细胞，培养后测定RLU并计算ID50或IC50。
检测ACE2表达稳定性
评估瞬时转染ACE2在CRFK细胞中的稳定性
在不同时间点（1小时、1天、2天）将ACE2转染的CRFK细胞感染LpVspike(+)，测定RLU。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation | -- | |
| 胰蛋白酶/EDTA溶液 | Nacalai Tesque | -- | |
| 假型病毒制备 | HIV-1 NL4-3 ΔEnv ΔVpr荧光素酶报告载体 | NIH AIDS Reagent Program | 3418 |
| 2019-nCov_pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP刺突质粒 | Nacalai Tesque | MC_0101087 | |
| Opti-MEM培养基 | -- | -- | |
| X-Treme HP转染试剂 | -- | -- | |
| 0.45微米滤膜 | Millipore | -- | |
| 生成ACE2表达细胞 | pcDNA3.1+/C-(K) DYK-ACE2质粒 | Nacalai Tesque | MC_0101086 |
| 中和试验 | 人抗SARS-CoV-2 IgG单克隆抗体 | Elabscience | E-AB-V1021 |
| 人抗SARS-CoV-2 IgM单克隆抗体 | Elabscience | E-AB-V1026 | |
| 人抗SARS-CoV-2 IgA单克隆抗体 | Elabscience | E-AB-V1027 | |
| 荧光素酶检测 | 细胞裂解液 | Toyo B-Net | -- |
| 发光底物 | -- | -- | |
| Nunc F96 MicroWell白色微孔板 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TriStar LB 941读板仪 | Berthold Technologies | -- | |
| 中和试验 | SARS-CoV-2患者血浆 | RayBiotech | -- |
| 细胞培养 | 多聚赖氨酸包被的96孔板 | Sumitomo Bakelite | ms-0096L |
| 96孔板 | Falcon | -- | |
| 假型病毒制备 | pSGΔenv载体 | NIH AIDS Reagent Program | 11051 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件：HEK293T（ATCC CRL 3216）、CRFK（ATCC CCL-94）、VeroE6（ATCC CRL 1586）、Cos7（ATCC CRL 1651）和TZM-bl（NIH ARP #8129） 阅读提示：Materials and Methods: 4.1 Cell Culture |
| 假型病毒制备 | 质粒和转染条件：HIV-1 NL4-3 ΔEnv ΔVpr Luciferase Reporter Vector和2019-nCov_pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP spike浓度均为1 µg/mL，转染时使用200 µL Opti-MEM和8 µL X-Treme HP 阅读提示：Materials and Methods: 4.2 Generation of Pseudo-Typed Lentivirus with SARS-CoV-2 S Particles |
| 生成ACE2表达细胞 | ACE2质粒（pcDNA3.1+/C-(K) DYK-ACE2）浓度2 µg/mL，使用X-Treme HP转染，孵育1天 阅读提示：Materials and Methods: 4.3 Generation of Transient ACE2-Expressing Cell Lines |
| 感染力检测 | 细胞密度2.3 × 10^4 cells/孔（96孔板），病毒体积100 µL/孔，感染后48小时测定RLU 阅读提示：Results: 2.1 and Figure 2 legend |
| 中和试验 | 病毒用量100 TCID50，血清起始稀释度1:60三倍稀释，单抗起始浓度10 µg/mL三倍稀释，预孵育1小时，培养2天 阅读提示：Materials and Methods: 4.4 Neutralization Assays |