年轻供体人去分化脂肪细胞和脂肪来源干细胞的体外分化潜能及mRNA表达谱的比较

Differentiation potential and mRNA profiles of human dedifferentiated adipose cells and adipose‑derived stem cells from young donors.

作者信息Fangfei Nie, Hongsen Bi, Chen Zhang, Pengbing Ding
PMID33200799
发布时间2021-01
DOI10.3892/mmr.2020.11685

实验完整度

包含细胞分离培养、增殖、表型、多向分化及转录组测序等实验,但缺乏动物或体内验证,机制研究有限。

主要模型

人去分化脂肪细胞(DAs) 人脂肪来源干细胞(ADSCs)

重点核对

细胞来源:3例年轻女性(23-30岁,BMI 19.1-23.9)的皮下脂肪组织 细胞传代:6-7代 分化诱导:成脂、成骨、成软骨、成肌条件 对照组:同一供体的DAs和ADSCs配对比对 统计标准:P<0.05

摘要

去分化脂肪细胞(DAs)和脂肪来源干细胞(ADSCs)是来源于脂肪组织的两种主要干细胞类型,据报道它们具有相似的特征,但也表现出独特的表型和功能优势。然而,关于它们在多向分化功能上的差异,一些报道结果并不一致。此外,据我们所知,尚无研究评估它们的分化潜能(特别是肌源性能力),或来自同一供体经肿胀吸脂术获得的脂肪抽吸物中这两种细胞类型转录组之间的差异。本研究旨在比较这两种细胞类型的特性和表达谱。获取了三位女性患者(年龄23-30岁)的皮下脂肪组织,其BMI在正常范围(19.1-23.9 kg/m²),取自腹部或大腿的肿胀吸脂术。通过胶原酶消化获得基质血管组分和成熟脂肪细胞,并连续培养ADSCs和DAs。为确定传代6-7代后DAs和ADSCs之间的差异,使用了细胞增殖实验、表型评估、分化实验和高通量RNA测序。观察到DAs和ADSCs具有相似的细胞形态、增殖动力学、表面标志物和转录组表达谱。尽管DAs和ADSCs在成骨、成脂、成软骨和成肌能力方面存在显著的个体差异,但仅基于细胞来源难以确定其分化潜能。有趣的是,成肌能力相对较强的细胞其成脂能力相对较弱。通过RNA-seq仅鉴定出186个组间差异表达基因。其中几个基因涉及转录调控、蛋白质翻译调控、细胞因子相互作用和能量代谢调节等生物学功能。本研究结果表明,在接受肿胀吸脂术的年轻供体中,DAs和ADSCs在再生领域具有相似的功能潜力,并存在同一细胞群体中分化能力的平衡。这些数据可能为脂肪组织来源干细胞在临床治疗中的进一步应用奠定基础。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
来自同一年轻供体经肿胀吸脂术获取的DAs和ADSCs在细胞特性、分化潜能和基因表达谱上有何差异?
核心机制
DAs和ADSCs在转录组水平上高度相似,仅186个基因差异表达;分化能力的个体差异可能受到多基因和表观遗传调控影响,其中BMP6基础表达与成软骨能力相关。
主要证据
通过细胞增殖、免疫表型分析、多向分化(成脂、成骨、成软骨、成肌)及RNA-seq对比三对细胞,发现两者增殖、表面标志物和转录组相似,分化能力存在个体差异。
研究意义
为脂肪组织来源干细胞在组织修复和再生医学中的应用提供实验依据,并提示个性化治疗的重要性。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

样本采集与细胞分离

获取同一供体的DAs和ADSCs以进行对比

从三位健康女性腹部或大腿的肿胀吸脂术获取皮下脂肪组织,通过胶原酶消化和离心分离获得基质血管组分(SVF)和成熟脂肪细胞(MAs),分别培养ADSCs和DAs。

2

细胞增殖和表型评估

比较DAs和ADSCs的增殖速率和表面标志物表达

使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性;通过流式细胞术检测CD90、CD44、CD105、CD31、CD34和CD45的表达。

3

多向分化能力检测

评估DAs和ADSCs成脂、成骨、成软骨和成肌分化能力

分别使用成脂、成骨、成软骨和成肌诱导培养基进行分化,并通过油红O、茜素红S、阿尔辛蓝和Desmin免疫荧光染色进行半定量分析。

4

转录组测序分析

比较DAs和ADSCs的基因表达谱并筛选差异表达基因

提取总RNA,进行Illumina NovaSeq平台RNA-seq,通过edgeR包筛选DEGs,并利用GO和KEGG富集分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
胶原酶I----
DMEM/F12培养基HyClone--
胎牛血清Biological Industries--
CCK-8试剂盒Dojindo Molecular Technologies--
抗CD90抗体ElabscienceE-AB-F1167D
抗CD44抗体ElabscienceE-AB-F1038D
抗CD31抗体ElabscienceE-AB-F1050C
抗CD34抗体ElabscienceE-AB-F1143C
抗CD45抗体ElabscienceE-AB-F1137C
抗CD105抗体eBioscience12-1057-41
BD FACS Aria II流式细胞仪BD Biosciences--
成脂分化培养基Cyagen Biosciences--
油红O----
成骨分化培养基Cyagen Biosciences--
茜素红S----
氯化十六烷基吡啶----
成软骨分化培养基Cyagen Biosciences--
阿尔辛蓝----
马血清Gibco--
地塞米松----
氢化可的松----
抗desmin抗体Abcamab32362
Cy3标记山羊抗兔IgG抗体Beyotime Institute of Biotechnology--
DAPI染料----
TRIzol试剂Thermo Fisher Scientific15596026
NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒NEB--
Illumina NovaSeq测序平台Illumina--
BCA蛋白定量试剂盒CW Biosciences--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本采集和细胞分离
供体年龄、BMI、取样部位、消化酶浓度和消化时间
阅读提示:Materials and methods: Ethical approval and sample collection; Isolation and culture of DAs and ADSCs
细胞增殖实验
细胞接种密度、检测时间点、CCK-8孵育时间
阅读提示:Materials and methods: Cell proliferation assay
免疫表型分析
抗体浓度、孵育时间、流式细胞仪设置
阅读提示:Materials and methods: Immunophenotypic assessment using flow cytometry
多向分化诱导
分化培养基成分、诱导时间、染色方法
阅读提示:Materials and methods: Multi-lineage differentiation assay
RNA-seq
RNA提取方法、文库构建试剂盒、测序平台、差异表达筛选标准
阅读提示:Materials and methods: Comparison of the gene expression profiles between DAs and ADSCs using RNA sequencing