验证α-syn纤维对c-src活性的影响及上游通路
探究α-syn纤维是否激活c-src，以及该激活是否依赖FcγRIIb-SHP-1/-2通路。
用α-syn纤维处理SH-SY5Y细胞和原代皮层神经元，通过Western blot检测c-src活性（pY416和pY527）；使用FcγRIIb、SHP-1、SHP-2敲低细胞及抑制剂处理验证通路依赖；并在A53T转基因小鼠脑组织中检测c-src活性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
c-src在α-突触核蛋白细胞间传播中的双重作用
The dual role of c-src in cell-to-cell transmission of α-synuclein.
实验完整度
高包含体外细胞模型（SH-SY5Y、原代皮层神经元）、基因敲低/过表达、药理学抑制、体内动物模型（A53T转基因小鼠）、病理学及免疫组织化学等多层次验证，并进行了机制（自噬、内吞）和功能验证。
主要模型
SH-SY5Y细胞 原代皮层神经元 A53T α-syn转基因小鼠（M83）
重点核对
α-syn纤维处理浓度（1 μM）及时间（30分钟） c-src抑制剂saracatinib（5 μM）和SKI-1（10 μM）的处理浓度 双室实验中共培养时间（12小时）及供体细胞分化条件（50 μM RA，5天） c-src敲低SH-SY5Y细胞系（KD #1: TRCN 0000038150, KD #2: TRCN 0000195339） 体内实验中M83小鼠周龄（2-3月龄）、α-syn纤维注射量（10 μg）及saracatinib给药方案（10 mg/kg/day，口服，4周）
摘要
帕金森病（PD）的特征是黑质致密部多巴胺能神经元的丧失，以及多个脑区出现称为路易小体（Lewy bodies）和路易神经突（Lewy neurites）的蛋白质包涵体。越来越多的证据表明，随着疾病进展，路易病理逐渐累及神经系统的更多区域，而α-突触核蛋白（α-syn）病理的朊病毒样传播促进了PD的进展。因此，调节α-syn的传播可能对开发PD患者的疾病修饰疗法具有重要意义。在这里，我们证明α-syn纤维诱导神经元中c-src的激活，这依赖于FcγRIIb-SHP-1/-2-c-src通路，并增强α-syn摄取进入神经元的信号。阻断c-src激活可抑制α-syn的摄取和路易小体样包涵体的形成。此外，阻断c-src激活还可通过激活自噬抑制α-syn的释放。可透过血脑屏障的c-src抑制剂saracatinib在体内模型系统中有效减少α-syn向邻近区域的传播。这些结果表明了一个针对进展性PD的新治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- c-src在α-syn细胞间传播中的作用及其机制是什么？
- 核心机制
- α-syn纤维通过FcγRIIb-SHP-1/-2通路激活c-src，激活的c-src增强脂筏依赖性内吞以促进α-syn摄取，同时抑制自噬从而促进α-syn的释放和积累，形成其在传播中的双重功能。
- 主要证据
- 体外实验显示c-src抑制剂和敲低减少α-syn摄取、路易小体样包涵体形成及释放；自噬标志物LC3II和p62检测表明抑制c-src增强自噬；体内M83小鼠模型中给予saracatinib减少α-syn病理传播和神经炎症。
- 研究意义
- 该研究提示c-src是帕金森病进展的潜在治疗靶点，c-src靶向药物可能被重新利用于帕金森病的治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证c-src对α-syn摄取的作用
探究c-src是否介导α-syn向神经元内的摄取。
使用双室实验将供体细胞（A53T α-syn-EGFP过表达SH-SY5Y）与受体细胞（SH-SY5Y或原代皮层神经元）共培养，检测受体细胞中α-syn的摄取；使用c-src抑制剂（saracatinib、SKI-1）、c-src敲低细胞以及过表达激酶活性或激酶死亡c-src突变体来验证c-src的作用。
验证c-src对路易小体样包涵体形成的作用
探究c-src是否影响α-syn在细胞内的聚集和路易小体样包涵体的形成。
将A53T α-syn-EGFP和A53T α-syn-mCherry过表达SH-SY5Y细胞共培养，在c-src抑制剂或c-src敲低条件下，通过共聚焦显微镜检测双荧光标记聚集点的数量。
验证c-src对α-syn释放和自噬的作用
探究c-src是否通过调控自噬影响α-syn的释放。
用ELISA检测培养上清中α-syn水平，评估c-src抑制或敲低对释放的影响；通过Western blot检测自噬标志物LC3II和p62，并使用bafilomycin A1（BafA）评估自噬流。
验证c-src对脂筏依赖性内吞的作用
探究c-src是否参与α-syn纤维诱导的脂筏依赖性内吞。
在α-syn纤维存在下，用荧光标记的转铁蛋白（clathrin依赖性内吞标志物）和BODIPY FL C5-LacCer（脂筏依赖性内吞标志物）处理细胞，通过共聚焦显微镜检测摄取情况。
体内验证c-src抑制对α-syn传播的影响
探究在体内抑制c-src能否减少α-syn病理的传播。
向2-3月龄M83小鼠纹状体注射α-syn纤维，随后口服给予saracatinib或溶媒对照4周，通过免疫组织化学检测pSer129 α-syn病理的传播和神经炎症标志物（GFAP、MHC class II）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 原代神经元培养 | Neurobasal培养基 | Invitrogen | -- |
| GlutaMAX™-I | Thermo | -- | |
| B-27添加剂 | Invitrogen | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 药物处理 | Saracatinib | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 动物实验 | Saracatinib | Cayman Chemical Company | -- |
| 药物处理 | SKI-1 | Sigma | -- |
| 视黄酸 | Sigma | -- | |
| 巴佛洛霉素A1 | Sigma | -- | |
| 抑制剂处理 | NSC87877 | -- | -- |
| PHPS-1 | -- | -- | |
| SSG | -- | -- | |
| 内吞实验 | BODIPY FL C5-乳糖神经酰胺 | Molecular Probes | -- |
| 罗丹明标记转铁蛋白 | Molecular Probes | -- | |
| Western blot | α-突触核蛋白抗体 | BD Biosciences | 610786 |
| SHP-1抗体 | BD Biosciences | 610126 | |
| SHP-2抗体 | BD Biosciences | 610621 | |
| 免疫组织化学 | MHC II类抗体 | BD Biosciences | 554926 |
| Western blot | 磷酸化c-src (Y416)抗体 | Cell Signaling Technology | 6943 |
| 磷酸化c-src (Y527)抗体 | Cell Signaling Technology | 2105 | |
| 总c-src抗体 | Cell Signaling Technology | 2123 | |
| pSer129 α-突触核蛋白抗体 | Abcam | ab51253 | |
| 免疫组织化学 | IBA-1抗体 | Wako | 019-19741 |
| pSer129 α-突触核蛋白抗体 | Wako | 015-25191 | |
| GFAP抗体 | Neuromics | RA22101 | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Calbiochem | -- |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | GenDEPOT | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| ELISA | 人α-突触核蛋白ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 细胞处理 | 重组人野生型α-突触核蛋白纤维 | -- | -- |
| 动物实验 | 2,2,2-三溴乙醇 | -- | -- |
| 组织处理 | 羟丙甲纤维素 | -- | -- |
| 吐温-80 | -- | -- | |
| 显微镜 | Axio Scan Z1玻片扫描仪 | Carl Zeiss | -- |
| BX51显微镜 | Olympus | -- | |
| 超声波处理 | 超声波处理器VC 505 | Sonics & Materials, Inc. | -- |
| 细胞分选 | FACSAria III流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| α-syn纤维制备及验证 | α-syn纤维制备条件：5 mg/ml单体α-syn，37°C，250 rpm摇动孵育2周，超声处理（3-5秒，3 W），-80°C保存。 阅读提示：见Materials and Methods中Reagents and antibodies部分 |
| 细胞培养 | SH-SY5Y细胞培养基（DMEM+10% FBS），原代皮层神经元分离自SD大鼠胚胎E18，培养基（Neurobasal+GlutaMAX-I+B-27）。 阅读提示：见Materials and Methods中Cell culture部分 |
| 药物处理 | c-src抑制剂浓度：saracatinib（5 μM）、SKI-1（10 μM），SHP-1/2抑制剂浓度：NSC87877（20 μM）、SSG（10 μM）、PHPS-1（1 μM）。 阅读提示：见Results部分及Figure 1、Figure 2等图注 |
| 双室/共培养实验 | 供体细胞（A53T α-syn-EGFP或WT α-syn OE SH-SY5Y）需50 μM RA处理5天分化，共培养时间12小时，受体细胞为SH-SY5Y或原代皮层神经元。 阅读提示：见Materials and Methods中Dual-chamber and coculture assays部分 |
| 动物实验 | 使用2-3月龄M83小鼠（B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J），纹状体注射10 μg α-syn纤维，saracatinib口服10 mg/kg/天持续4周。 阅读提示：见Materials and Methods中Intracerebral injection and drug treatment部分 |