GLOE-Seq方法验证
验证GLOE-Seq的准确性、特异性和灵敏度。
利用纯化的酿酒酵母基因组DNA，经BsrDI、Nb.BsrDI等酶切处理，进行GLOE-Seq文库制备和测序，通过GLOE-Pipe分析检测预期位点，并与EndoSeq比较。
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GLOE-Seq全基因组核苷酸分辨率绘制DNA复制模式、单链断裂和损伤图谱
Genome-wide Nucleotide-Resolution Mapping of DNA Replication Patterns, Single-Strand Breaks, and Lesions by GLOE-Seq.
实验完整度
高包含方法验证（体外酶切、灵敏度稀释）、体内损伤和修复中间体检测（UV、MMS、HO内切酶）、酵母和人类复制模式分析以及人类细胞中连接酶功能研究等至少两个独立证据层级。
主要模型
酿酒酵母W303、JKM179、DF5及衍生株 人HCT116细胞系及LIG3−/−:mL3衍生株
重点核对
酿酒酵母菌株W303、JKM179、DF5及cdc9AID毒株 人HCT116和LIG3−/−:mL3细胞 MMS处理浓度0.02%及处理时间30分钟 UV照射剂量20和120 J/m² 连接酶1敲低（siLIG1）和连接酶3敲除
摘要
我们提出了一种基于捕获3′-OH末端后进行测序（GLOE-Seq）的方法，用于在纯化的基因组DNA中实现全基因组、核苷酸分辨率的DNA单链断裂定位。我们验证了该方法，并展示了其在定位人类和酵母冈崎片段、自发性单链断裂以及多种其他DNA损伤方面的适用性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何实现全基因组、核苷酸分辨率定位DNA单链断裂及相关损伤和复制中间体，并探究自发性单链断裂的分布规律？
- 核心机制
- 通过连接3′-OH末端捕获DNA断裂，结合生物素化接头和测序实现全基因组断裂定位；人类细胞中连接酶1是主要的复制性DNA连接酶，连接酶3在连接酶1缺失时起重要的补充作用。
- 主要证据
- 通过体外酶切验证（BsrDI/Nb.BsrDI）、与EndoSeq比较、在酵母中检测UV和MMS诱导的损伤及修复中间体、在酵母和人类细胞中分析冈崎片段和复制模式（RFD）等支持。
- 研究意义
- GLOE-Seq可广泛应用于与单链断裂相关的医学因素或治疗研究，区分单链断裂与双链断裂，并可用于评估不涉及双链断裂的基因组编辑技术的选择性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测自发单链断裂分布
绘制酵母基因组中自发性单链断裂的全基因组分布。
制备未经处理的酵母基因组DNA，进行GLOE-Seq测序，并使用超声打断的DNA作为随机断裂对照，分析断裂在着丝粒、端粒等区域的富集情况。
检测体内DNA损伤和修复中间体
验证GLOE-Seq是否能定位体内产生的双链断裂、嘧啶二聚体和烷基化损伤及修复中间体。
使用JKM179菌株诱导HO内切酶产生DSB；用UV照射DF5菌株，基因组DNA用T4核酸内切酶V和APE1处理；用MMS处理DF5和apn1Δapn2Δ菌株，基因组DNA用AAG和APE1处理或不处理，进行GLOE-Seq分析。
分析酵母复制模式（冈崎片段）
验证GLOE-Seq无需大小选择即可绘制冈崎片段图谱。
使用cdc9AID菌株进行辅助素诱导Cdc9降解，抑制冈崎片段连接，然后制备基因组DNA进行GLOE-Seq，分析RFD指数和断点分布。
分析人类细胞复制模式
测试GLOE-Seq在人类基因组中的应用，评估不同连接酶对冈崎片段成熟的影响。
在HCT116和LIG3−/−:mL3细胞中，用siRNA敲低连接酶1或使用对照siRNA，制备基因组DNA进行GLOE-Seq，分析RFD图谱、细胞周期和CHK1磷酸化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
GLOE-Seq文库制备
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 酶切处理 | BsrDI限制酶 | New England Biolabs | R0574 |
| Nb.BsrDI切口酶 | New England Biolabs | R0648 | |
| NotI限制酶 | New England Biolabs | R0189 | |
| Nb.BtsI切口酶 | New England Biolabs | R0707 | |
| 去磷酸化处理 | 南极磷酸酶 | New England Biolabs | M0289 |
| UV损伤处理 | T4核酸内切酶V | New England Biolabs | M0308 |
| BER中间体检测 | 人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1 | New England Biolabs | M0282 |
| MMS损伤检测 | 人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶 | New England Biolabs | M0313 |
| 细胞转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778150 |
| DNA提取 | 酵母基因组DNA提取试剂盒 | QIAGEN | 10243 |
| DNA纯化 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 |
| 核酸定量 | Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Invitrogen | Q32854 |
| 文库制备 | NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7645 |
| 测序 | NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 酵母GLOE-Seq | 菌株（W303/JKM179/DF5）、酶切条件（酶浓度、温度、时间）、DNA用量、测序深度 阅读提示：STAR Methods, GLOE-Seq Library Preparation (S. cerevisiae) 和 Validation of the GLOE-Seq Method |
| UV损伤检测 | UV剂量（20/120 J/m²）、T4 Endonuclease V和APE1处理条件 阅读提示：STAR Methods, Mapping of Pyrimidine Dimers in Yeast |
| MMS损伤检测 | MMS浓度（0.02%）、处理时间（30分钟）、菌株（DF5和apn1Δ apn2Δ）、AAG和APE1处理条件 阅读提示：STAR Methods, Mapping of MMS Damage and Repair in Yeast |
| 酵母冈崎片段分析 | cdc9AID菌株、α因子同步、辅助素处理、释放时间、去磷酸化处理 阅读提示：STAR Methods, Mapping of Okazaki Fragments in Yeast |
| 人类细胞连接酶敲低 | 细胞系（HCT116和LIG3−/−:mL3）、siRNA类型和浓度、转染时长、细胞培养条件 阅读提示：STAR Methods, Ligase 1 Depletion in Human Cells |