蛋白质组学筛选与验证
探索MLN4924处理AML细胞后显著改变的蛋白和通路，寻找潜在联合靶点。
对Kasumi-1细胞进行MLN4924或DMSO处理24小时，进行Astral-DIA蛋白质组学分析，鉴定差异蛋白并进行KEGG富集分析，发现GLUL显著上调；通过RT-qPCR和Western blot验证。
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靶向谷氨酰胺转运体SLC1A5增强急性髓系白血病对MLN4924的敏感性
Targeting the Glutamine Transporter SLC1A5 Enhances Sensitivity of Acute Myeloid Leukemia to MLN4924.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK-8、RT-qPCR、Western blot、流式）、体内CDX模型及转录组分析等多个独立证据层级，并包含功能验证（敲低、抑制剂）和机制验证（TCA循环）。
主要模型
人AML细胞系Kasumi-1 人AML细胞系MOLM-13 NCG小鼠MOLM-13细胞皮下异种移植模型 AML患者和健康供者公共数据库数据队列
重点核对
MLN4924和V9302的浓度及处理时间（如Kasumi-1联合浓度1.6 μM和4 μM，MOLM-13为0.32 μM和10 μM） 谷氨酰胺剥夺或补充的浓度（2 mM vs 6 mM） shRNA敲低SLC1A5或siRNA敲低GLUL的效率验证 体内模型中药物剂量和给药方式（MLN4924 60 mg/kg，V9302 20 mg/kg，每日一次腹腔注射） TCA循环相关基因表达的检测（RNA-seq）
摘要
背景/目的：急性髓系白血病（AML）仍是一种预后不良的血液系统恶性肿瘤。Neddylation抑制剂MLN4924在临床前模型中显示出强效抗白血病活性，但其临床转化面临重大挑战。本研究旨在探索能够进一步增强MLN4924抗白血病潜力的联合治疗策略。方法：本研究所用AML细胞系为Kasumi-1和MOLM-13。细胞活力通过CCK-8实验评估。mRNA和蛋白表达水平分别通过RT-qPCR和Western blot测定。流式细胞术用于分析表面标志物（SLC1A5、CD11b、CD14、CD16）、线粒体膜电位（JC-1）和凋亡（Annexin V-FITC/PI）。体内疗效通过NCG小鼠异种移植模型验证。转录组学分析用于探索MLN4924联合V9302抑制白血病的潜在机制。结果：MLN4924处理显著上调AML细胞中关键谷氨酰胺代谢蛋白GLUL和谷氨酰胺转运体SLC1A5。敲低SLC1A5显著增强AML细胞对MLN4924的敏感性。MLN4924与SLC1A5抑制剂V9302联合用药协同抑制AML细胞增殖，诱导单核细胞分化并促进凋亡。转录组分析显示，该联合治疗显著抑制三羧酸（TCA）循环。结论：Neddylation抑制诱导AML中谷氨酰胺代谢的补偿性上调。共同靶向neddylation和谷氨酰胺转运体SLC1A5协同发挥抗白血病作用，至少部分通过破坏TCA循环实现。该联合策略代表一种新的、有效的AML治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探索增强MLN4924抗白血病疗效的联合治疗策略，具体聚焦于谷氨酰胺代谢在AML中的作用。
- 核心机制
- MLN4924处理诱导AML细胞谷氨酰胺代谢重编程，补偿性上调GLUL和SLC1A5；联合抑制SLC1A5与neddylation可协同抑制AML，部分通过抑制TCA循环实现。
- 主要证据
- 体外实验显示联合用药协同抑制增殖、诱导分化和凋亡；体内CDX模型证实肿瘤生长抑制；RNA-seq显示TCA循环相关基因显著下调。
- 研究意义
- 该联合策略代表一种新的、有效的AML治疗策略，为靶向代谢途径治疗AML提供了证据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
谷氨酰胺代谢重编程验证
验证MLN4924是否促进谷氨酰胺消耗并上调SLC1A5，以及GLUL上调是否与谷氨酰胺相对缺乏有关。
通过检测培养基中谷氨酰胺消耗、Western blot检测SLC1A5表达、流式检测细胞表面SLC1A5，并利用谷氨酰胺剥夺或补充实验验证GLUL表达。
临床相关性分析
分析GLUL和SLC1A5在AML患者中的表达及与预后的关系。
从BloodSpot和UALCAN数据库获取数据，分析基因表达差异和生存相关性。
功能验证：GLUL和SLC1A5抑制
验证抑制GLUL或SLC1A5对AML细胞对MLN4924敏感性的影响。
通过siRNA敲低GLUL、shRNA敲低SLC1A5，以及使用抑制剂MSO和V9302，结合CCK-8检测细胞活力。
联合用药体外功效评估
评估MLN4924联合V9302对AML细胞增殖、分化、凋亡和细胞周期的影响。
通过CCK-8、流式细胞术（检测CD11b、CD14、CD16、Annexin V-FITC/PI、JC-1）和Western blot（Caspase-3）检测联合处理效果。
体内抗白血病效果验证
验证MLN4924联合V9302在体内对AML细胞生长的抑制作用。
建立NCG小鼠皮下异种移植模型（MOLM-13细胞），给予MLN4924、V9302或联合治疗，监测肿瘤体积和体重，并进行HE染色评估安全性。
转录组机制解析
探索MLN4924联合V9302协同抑制AML的分子机制。
对四组（对照组、MLN4924单药、V9302单药、联合组）进行RNA-seq分析，鉴定差异表达基因并进行KEGG和GSEA富集分析，发现TCA循环被显著抑制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | Cellbox | -- | |
| 药物处理 | MLN4924 | TargetMol | -- |
| V9302 | MedChemExpress | -- | |
| APTO-253 | TargetMol | -- | |
| MSO | MedChemExpress | -- | |
| RNA提取与qPCR | SPARKeasy RNA纯化试剂盒 | SparkJade | -- |
| SPARKscript II 一步法RT SuperMix（qPCR） | SparkJade | -- | |
| SYBR Green qPCR混合液 | SparkJade | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Share-Bio | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 无蛋白快速封闭液 | Epizyme | -- | |
| 增强化学发光检测试剂盒 | Epizyme | -- | |
| Western blot快速剥离缓冲液 | Epizyme | -- | |
| SLC1A5抗体 | Proteintech | 20350-1-AP | |
| GLUL抗体 | Epizyme | R014807 | |
| GAPDH抗体 | Epizyme | LF205 | |
| Caspase-3抗体 | STARTER-Bio | S0B0368 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Gooniebio | -- |
| 谷氨酰胺消耗检测 | 谷氨酰胺检测试剂盒 | LABGIC | BL1411B |
| 基因敲低 | 小干扰RNA | Sangon Biotechnology | -- |
| shRNA慢病毒颗粒 | Genechem | -- | |
| 嘌呤霉素 | Beyotime | -- | |
| 流式分析 | SLC1A5抗体 | Proteintech | 20350-1-AP |
| 驴抗兔IgG-APC抗体 | Absin | -- | |
| CD11b抗体 | Proteintech | FITC-65582 | |
| CD14抗体 | Epizyme | 83F86E77 | |
| CD16抗体 | Epizyme | 52Q46N54 | |
| 细胞周期分析 | 细胞周期检测试剂盒 | Epizyme | -- |
| 细胞凋亡分析 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Epizyme | -- |
| 线粒体膜电位分析 | JC-1染料试剂盒 | Solarbio | -- |
| 细胞形态学分析 | Wright-Giemsa染色 | -- | -- |
| 光学显微镜 | Nikon | -- | |
| 蛋白质组学 | Vanquish Neo系统 | Thermo Scientific | -- |
| Astral高分辨质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| RNA-seq | 2100生物分析仪 | -- | -- |
| ND-2000 | NanoDrop Technologies | -- | |
| Illumina Truseq RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 动物实验 | NCG小鼠 | GemPharmatech | T001475 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（Kasumi-1来自ATCC，MOLM-13由郭远成博士提供），培养基类型（RPMI-1640含或不含L-谷氨酰胺），谷氨酰胺浓度（2 mM），血清浓度（10% FBS），培养条件（37℃，5% CO2） 阅读提示：2.1 Cell Culture and Reagents |
| 药物处理 | MLN4924和V9302的浓度、处理时间（如24小时、48小时）、溶剂对照（DMSO） 阅读提示：图1A、图5F、图5G、图2D-I |
| 基因敲低 | siRNA或shRNA序列、转染或感染效率、敲低时间（48小时）、筛选浓度（嘌呤霉素） 阅读提示：2.7、2.8 Knockdown of GLUL / SLC1A5 |
| 体内实验 | 小鼠品系（NCG，雌性，6周龄）、细胞接种量（2×10^6）、给药剂量（MLN4924 60 mg/kg，V9302 20 mg/kg，每日一次腹腔注射）、治疗开始时间（接种后一周）、观察终点（第15天） 阅读提示：2.13 AML CDX Models、图7A |
| RNA-seq分析 | 测序平台（Illumina NovaSeq 6000）、文库构建试剂盒、数据分析流程（差异表达基因阈值，GO/KEGG富集） 阅读提示：2.12 RNA-Seq and Data Analysis |