子宫内膜类器官建立与鉴定
获得具有子宫内膜腺上皮细胞特征的体外三维模型。
从三名健康患者子宫内膜活检样本中分离腺体，包埋于Matrigel中培养，通过形态学和免疫荧光（CK18、E-cadherin、MUC1）鉴定。
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多囊卵巢综合征样类器官模型的代谢谱分析揭示了谷氨酰胺在着床失败相关局部子宫内膜失调中的关键作用
Metabolic profiling of a polycystic ovary syndrome-like organoid model reveals the critical role of glutamine in local endometrial dysregulation related to implantation failure.
实验完整度
中包含类器官培养、激素处理、代谢组学、细胞功能实验及胚胎黏附实验，但缺少动物模型和患者样本验证，且机制验证未深入。
主要模型
子宫内膜类器官（EOs） 人子宫内膜基质细胞（hESCs） Ishikawa细胞与滋养层干细胞（hTSCs）共培养模型
重点核对
类器官来源于健康子宫内膜组织的三个病例 激素处理方案：对照组（无激素）、正常组（0.1nM E2+0.8nM T至1nM E2+1.25nM T）、PCOS样组（0.1nM E2+3nM T至1nM E2+3nM T） 代谢组学分析采用Q300靶向代谢组学 细胞实验确定2mM谷氨酰胺为最佳浓度促进蜕膜化 胚胎黏附实验：hTSC球体与Ishikawa细胞层共培养，计算黏附率和侵袭率
摘要
多囊卵巢综合征（PCOS）是一种常见的以内分泌和代谢紊乱为特征的疾病，可导致慢性无排卵，进而增加非典型子宫内膜增生和癌变的发病率。越来越多的证据表明，代谢变化可能在PCOS发病机制中起关键作用；然而，PCOS相关子宫内膜液中代谢谱尚未被表征。在本研究中，我们成功构建了来自临床健康子宫内膜的三例子宫内膜类器官。通过添加不同比例的雌二醇和睾酮，建立了高雄激素模型来模拟PCOS样特征。通过扫描电子显微镜和免疫荧光检测，我们发现额外雄激素处理诱导的细胞损伤导致细胞碎片和凋亡。将类器官的类器官内液（IOF）和类器官外液（EOF）分离，并通过高通量定量代谢组学进行分析。结果显示，氨基酸代谢，特别是谷氨酰胺代谢变化，是EOF中改变的主要代谢途径；同时，各组间IOF中脂肪酸的变化是主要代谢物。具体而言，体外模型证实谷氨酰胺增强子宫内膜基质细胞蜕膜化并改变线粒体功能，在着床过程中可能为代谢标志物筛选以及确定与PCOS相关的女性不孕的潜在代谢干预靶点提供基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PCOS样高雄激素环境下子宫内膜局部代谢改变及其对着床失败的影响。
- 核心机制
- 谷氨酰胺代谢改变影响子宫内膜基质细胞蜕膜化，部分通过调节线粒体活性，进而影响胚胎着床。
- 主要证据
- 代谢组学显示EOF中谷氨酰胺显著上调，体外实验表明2mM谷氨酰胺增强hESC蜕膜化，且谷氨酰胺缺乏或雄激素处理降低hTSC球体黏附与侵袭。
- 研究意义
- 为PCOS相关不孕的代谢标志物筛选及潜在代谢干预靶点提供依据，但需更大样本验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
高雄激素模型构建及形态学评估
模拟PCOS样激素环境，观察雄激素对类器官细胞形态和结构的影响。
通过不同E2和T浓度处理类器官14天，采用TEM观察细胞超微结构，免疫荧光和Western blot检测AR和ER表达，TUNEL检测凋亡。
代谢组学分析EOF和IOF
比较PCOS样组与正常及对照组在类器官腔内外代谢物差异。
提取EOF和IOF，采用Q300靶向代谢组学检测，通过PCA、OPLS-DA等分析显著差异代谢物及富集通路。
谷氨酰胺对子宫内膜基质细胞蜕膜化的影响
验证谷氨酰胺浓度变化对蜕膜化的影响。
用不同浓度谷氨酰胺（0,2,4mM）处理hESC，并添加雌激素和孕激素及cAMP刺激蜕膜化，通过RT-qPCR检测蜕膜化标志基因（IL-11、IGFBP1、LIF、HOXA10）和免疫荧光检测COX2表达。
谷氨酰胺对线粒体功能的影响
探究谷氨酰胺是否通过调节线粒体活性影响蜕膜化。
通过免疫荧光检测TOMM20和OPA1评估线粒体数量，RT-qPCR检测线粒体融合和分裂相关基因表达。
体外胚胎着床模型验证
评估谷氨酰胺和雄激素对胚胎附着的影响。
使用hTSC球体模拟胚胎，与Ishikawa细胞共培养，在谷氨酰胺缺乏或雄激素处理下检测黏附率和侵袭率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织采集与清洗 | 磷酸盐缓冲液 | Biosharp | -- |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 组织消化 | 苄基十二烷基二甲基溴化铵 | Macklin | -- |
| I型胶原酶 | HARVEYBIO | -- | |
| 类器官培养 | Advanced DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 类器官消化与冻存 | TrypLE Express消化液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞冻存液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光和TUNEL | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | Macklin | -- | |
| 抗小鼠IgG-Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗兔IgG-Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| TUNEL试剂盒 | Vazyme | A113 | |
| 激素处理 | 雌二醇 | Sigma | -- |
| 睾酮 | Hkhcbio | -- | |
| TEM分析 | Leica UC7超薄切片机 | Leica | -- |
| Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜 | FEI Company | -- | |
| 代谢组学 | 甲醇 | Sigma | -- |
| 超高效液相色谱-质谱联用 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| 活性炭剥离胎牛血清 | BI | -- | |
| 环磷酸腺苷 | Sigma | -- | |
| 胚胎黏附实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| CellTracker红色荧光染料 | MCE | -- | |
| CellTracker蓝色荧光染料 | MCE | -- | |
| RT-qPCR | TB Green Premix Ex Taq II试剂盒 | Takara | RR820A |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官培养 | 供体年龄、激素状态、活检部位、类器官培养代数、生长因子配方 阅读提示：Methods 2.1，Supplementary Table S1和S2 |
| 激素处理 | 雌二醇和睾酮浓度、处理时间、分组设置 阅读提示：Methods 2.3，Figure 2A |
| 代谢组学 | EOF和IOF提取方法、QC参数、样本量、统计方法 阅读提示：Methods 2.5, 2.6, 2.9 |
| 细胞蜕膜化实验 | 谷氨酰胺浓度、激素刺激浓度、处理时间、检测标志基因 阅读提示：Methods 2.7，Figure 5 |
| 胚胎黏附实验 | hTSC球体数量、黏附率计算方法、共培养时间 阅读提示：Methods 2.7，Figure 6 |