临床队列:围手术期肠道菌群变化分析
评估胸腔镜手术患者围手术期肠道菌群组成和氧代谢表型的变化及其与临床预后的关系。
收集71例胸腔镜肺部分切除患者的术前和术后粪便样本,进行16S rRNA基因测序,使用Bugbase预测氧代谢表型,并分析其与术后并发症和住院时间的关联。
Elevated postoperative IL-1β induces disorder of intestinal microenvironment and alteration of gut microbiota.
包含临床队列(71例胸腔镜手术患者)和多时间点小鼠模型,结合16S rRNA测序、Bugbase表型预测、ELISA、组织缺氧染色、ATP/乳酸检测及IL-1β siRNA/rIL-1β干预等体外和体内验证。
胸腔镜手术患者临床队列(71例) 手术/麻醉应激小鼠模型(探索性开腹手术) 小鼠巨噬细胞系(用于siRNA筛选)
胸腔镜手术患者:术前术后配对粪便样本,16S rRNA基因测序和Bugbase表型分析 小鼠手术/麻醉应激模型:2.5-3%七氟烷麻醉下开腹手术,2小时麻醉时间 IL-1β siRNA通过尾静脉注射(10 nmol),rIL-1β通过腹腔注射(10 μg/kg) 结肠上皮检测:pimonidazole HCl(60 mg/kg)缺氧染色、ATP和乳酸测定 统计:使用Wilcoxon符号秩检验、线性回归和逻辑回归调整多个混杂因素
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估胸腔镜手术患者围手术期肠道菌群组成和氧代谢表型的变化及其与临床预后的关系。
收集71例胸腔镜肺部分切除患者的术前和术后粪便样本,进行16S rRNA基因测序,使用Bugbase预测氧代谢表型,并分析其与术后并发症和住院时间的关联。
探讨术后外周炎症指标(尤其是IL-1β)与肠道菌群氧代谢表型的关系。
通过ELISA检测术后IL-1β和IL-6水平,并与其他炎症指标(TNF-α、CRP、PCT等)一起,与术后菌群氧代谢表型进行相关性和回归分析。
验证手术/麻醉应激是否复制临床观察到的菌群氧代谢表型转变和结肠环境变化。
建立小鼠开腹手术模型,在术后多个时间点(24小时、1周、2周、3周)检测血清和结肠IL-1β水平、粪便细菌总量,并在1周时进行16S测序和结肠组织学检测。
探讨IL-1β是否直接导致结肠氧环境破坏和菌群表型改变。
通过尾静脉注射IL-1β siRNA(10 nmol)或腹腔注射rIL-1β(10 μg/kg)调节小鼠IL-1β水平,然后检测结肠ATP、乳酸、缺氧评分和菌群表型。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA基因测序 | E.Z.N.A.® 土壤DNA提取试剂盒 | Omega Bio-tek | -- |
| NanoDrop 2000紫外可见分光光度计 | Thermo Scientific | -- | |
| ABI GeneAmp® 9700 PCR热循环仪 | ABI | -- | |
| AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 | Axygen Biosciences | -- | |
| Quantus™荧光计 | Promega | -- | |
| Illumina MiSeq平台 | Illumina | -- | |
| 实时荧光定量PCR | QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒 | Qiagen | -- |
| CFX96系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine™ 3000转染试剂 | -- | -- |
| 细胞培养 | CM-M048培养基 | Procell | -- |
| siRNA递送 | Invivofectamine™ 3.0转染试剂 | -- | -- |
| 缺氧染色 | Hypoxyprobe™-1试剂盒 | Hypoxyprobe | -- |
| 抗哌莫硝唑单克隆IgG1抗体 | -- | -- | |
| HRP标记的山羊抗兔抗体 | Jackson Immuno Research Laboratories | -- | |
| ELISA | 人IL-1β ELISA试剂盒 | Sigma | RAB0273 |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | Sigma | RAB0306 | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | ExCell Bio | EM001 | |
| 动物实验 | 加热毯 | Two Little Fishies | 366 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床队列 | 纳入标准:胸腔镜肺部分切除术患者;排除标准见补充图1;配对粪便和血液样本;术后并发症Clavien-Dindo分类;围手术期抗生素使用 阅读提示:Materials and methods: Clinical cohort and patient data |
| 16S rRNA测序和Bugbase分析 | DNA提取试剂盒品牌;PCR引物(338F/806R);测序平台(Illumina MiSeq 2×300);OTU聚类(97%相似度);Bugbase表型预测数据库(Greengene) 阅读提示:Materials and methods: Microbiota analysis |
| 动物手术/麻醉应激模型 | 小鼠品系、年龄、性别(8周龄雄性);麻醉:2.5-3%七氟烷,2小时;手术步骤:中线开腹,探查肝脾肾膀胱;术后镇痛:罗哌卡因0.1% 3mg/kg皮下注射 阅读提示:Materials and methods: Animal surgery/anesthesia stress model; Figure 3A |
| IL-1β干预 | IL-1β siRNA序列和化学修饰(胆固醇偶联和2'-O-甲基修饰);siRNA剂量(10 nmol)和给药途径(尾静脉注射)及时间(术前2天);rIL-1β剂量(10 μg/kg)和给药途径(腹腔注射) 阅读提示:Materials and methods: IL-1β siRNA sequence selection; Chemically modified IL-1β siRNA and the in vivo knockdown effect validation in a mouse LPS model; Figure 4A |
| 结肠环境检测 | 缺氧染色:pimonidazole HCl(60 mg/kg)腹腔注射处死前1小时;评分标准(0-3);ATP和乳酸测定试剂盒(Biovision);结肠上皮细胞取样方法 阅读提示:Materials and methods: Hypoxic staining of colon epithelia; ATP and lactate measurements of colon tissue |