2型糖尿病中线粒体相关关键基因的鉴定及知母-黄柏药对作用机制的阐明：生物信息学、机器学习与实验验证的整合方法

背景：线粒体损伤通过损害细胞能量代谢和胰岛素敏感性，在2型糖尿病（T2DM）发病机制中发挥关键作用。知母-黄柏药对（ZB）是由知母和黄柏组成的经典中药配方，对T2DM有疗效，但其分子机制尚不清楚。本研究旨在鉴定2型糖尿病的关键线粒体相关基因及ZB的潜在机制。方法：从GEO数据库获取T2DM基因表达数据集（GSE76894、GSE25724和GSE38642）。通过筛选多个数据库（包括TCMSP和HERB）鉴定ZB药对和T2DM的交集靶点。从人类线粒体相关数据库获取线粒体功能相关基因。采用WGCNA鉴定差异表达基因，然后与生物活性成分-靶基因和线粒体相关基因取交集，构建PPI网络。随后进行GO和KEGG富集分析。应用四种机器学习算法——SVM-RFE、RF、GLM和XGB——筛选特征基因并建立诊断模型。此外，分析特征靶点与免疫细胞浸润的相关性，进行单基因GSEA，并进行分子对接以研究特征靶点与ZB生物活性成分之间的相互作用。实验验证方面，将INS-1细胞分为六组：对照组、模型组、二甲双胍组以及ZB低、中、高剂量组。评估细胞活力、凋亡、ROS水平、线粒体膜电位以及线粒体形态和功能。进行Western blot分析以评估线粒体相关基因（BCAT2、CASP8、EPHX2和UCP2）和AMPK–SIRT1–PGC-1α信号通路组分的表达。结果：共鉴定出8个与ZB治疗T2DM相关的线粒体相关差异表达基因。GO分析显示在多个生物学过程中富集，包括对营养水平的反应；细胞组分，如孔复合物；分子功能，包括有毒物质结合。KEGG通路分析表明在凋亡、p53信号通路和坏死性凋亡等通路中显著富集。通过机器学习算法筛选出三个关键基因——BCAT2、CASP8和EPHX2，构建的T2DM诊断模型均显示出大于0.7的曲线下面积（AUC）值，表明具有令人满意的判别性能。免疫浸润分析显示，所有三个关键基因均与免疫细胞群体显著相关。分子对接结果表明，三个关键基因与其对应的ZB生物活性化合物表现出强结合亲和力（≤−5.0 kcal/mol），但CASP8-烟酰胺组合除外。实验验证显示，ZB显著增强了高糖高脂条件下INS-1细胞的活力，抑制了凋亡，减少了细胞内ROS生成，并改善了线粒体膜电位、线粒体形态和呼吸功能。同时，UCP2和BCAT2的蛋白表达水平显著上调，而CASP8和EPHX2显著下调。此外，ZB处理上调了p-AMPK/AMPK比值以及SIRT1和PGC-1α的表达。结论：以BCAT2、CASP8和EPHX2为特征的诊断模型为T2DM的诊断和治疗提供了新的见解。ZB的治疗机制涉及调节线粒体相关基因（BCAT2、CASP8、EPHX2、UCP2）和激活AMPK-SIRT1-PGC-1α通路，从而改善线粒体形态和功能，减少氧化损伤，增强能量代谢。