啮齿动物采样与生态区划分
收集不同生态区的啮齿动物样本，以代表云南省环境多样性。
从2021年6月至2024年3月，在云南省20个县区用活捕笼捕获624只啮齿动物，解剖后取肠道和肺组织，按采样地点和组织类型分为82个池，提取RNA进行测序。
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云南省不同生态区域啮齿动物RNA病毒特征及其进化模式与复制潜能分析
Characteristics of RNA viruses in rodents across different ecological regions of Yunnan and analysis of their evolutionary patterns and replication potential.
实验完整度
高包含野外采样、宏转录组测序、系统发育分析、贝叶斯进化分析、病毒分离及细胞增殖实验等多个独立证据层级，并有功能验证。
主要模型
褐家鼠 (Rattus norvegicus) 黄胸鼠 (Rattus tanezumi) Vero E6细胞 NRK-52E大鼠肾细胞 BRL大鼠肝细胞 人细胞系A549、HRT-18、HepG2、HuH7
重点核对
采样地点的生态区划分基于Köppen-Geiger气候分类，分为NYPR、CYPR、WYAC、SYTM、SYHM、NWAC六个区域 组织样本按地点和类型共分为82个池，每个池平均14.5个样本 病毒丰度以RPM表示，设定RPM>1作为阈值以减少假阳性 细胞增殖实验以感染复数(MOI)为1进行接种，病毒载量检测时间点为感染后0至5天 统计显著性使用t检验(P<0.05)和Adonis检验(P=0.09)进行病毒组差异分析
摘要
背景：啮齿动物是人畜共患病毒的储存库，对公共卫生构成重大威胁。本研究使用宏转录组学分析，对来自中国云南省六个生态区的624只啮齿动物进行了RNA病毒组研究，以探索病毒多样性、区域分布和进化特征。结果：在云南高原东北部和中部观察到较高的病毒组多样性，而在西北部冷温带地区多样性较低。系统发育分析鉴定出一个独特的首尔病毒谱系，代表一个祖先株，同时强调了跨种传播事件。沙粒病毒科和冠状病毒科在特定区域富集，并观察到组织特异性病毒偏好，例如肠道组织中的轮状病毒和肺组织中的首尔病毒。分离出四种人畜共患病毒株，并在啮齿动物细胞中表现出有效复制，但在人细胞系中适应性有限。结论：这些发现强调了生态因素在塑造病毒进化中的重要性，并强调持续监测的必要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 云南省不同生态区域内啮齿动物携带的RNA病毒多样性和分布如何，以及其进化模式和复制潜能如何？
- 核心机制
- 生态因素塑造病毒进化，表现为区域特异的病毒科富集以及首尔病毒存在一个云南特异的进化谱系（H谱系），其祖先可追溯至约1305年。
- 主要证据
- 宏转录组测序分析鉴定出25个哺乳动物病毒科，系统发育分析显示多个病毒科存在地理聚集，分离出四种病毒株（J4、Q7、N42、W49）在啮齿动物细胞中复制，但在人细胞系中增殖效率低。
- 研究意义
- 研究强调了持续监测的重要性，并为理解生态因素在病毒进化中的重要性提供了框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
病毒组测序与多样性分析
描述不同生态区和组织中的病毒组成，并比较区域间差异。
对RNA池进行转录组测序，去除核糖体RNA，将读段比对到病毒基因组，计算RPM，并设定阈值。使用Shannon指数和主坐标分析比较α和β多样性，使用LEfSe分析不同生态区和组织的病毒科丰度差异。
病毒系统发育和进化分析
确定关键病毒科的系统发育关系，并推断首尔病毒的进化历史。
对十种主要病毒科序列进行系统发育分析，构建最大似然树。对首尔病毒S和M段进行全长扩增和测序，构建系统发育树、进行贝叶斯MCC分析、氨基酸替换和迁移分析。
病毒分离和增殖潜力评估
评估具有潜在人畜共患风险的病毒株在啮齿动物细胞和人细胞系中的复制能力。
从阳性肺样本中分离四种病毒株（J4、Q7、N42、W49），接种于同源或易感细胞系和人细胞系，定量PCR检测病毒载量，分析增殖曲线。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取与建库测序 | Magen RNA试剂盒 | Magen | -- |
| Qubit 3.0荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Nanodrop One分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Agilent 4200生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| VAHTS Universal V10 RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme | -- | |
| Illumina NovaSeq X Plus测序仪 | Illumina | -- | |
| 病毒分离与增殖 | DMEM培养基 | -- | -- |
| Vero E6细胞 | Procell | -- | |
| NRK-52E细胞 | Procell | -- | |
| BRL细胞 | Procell | -- | |
| A549细胞 | Procell | -- | |
| HRT-18细胞 | Procell | -- | |
| HepG2细胞 | Procell | -- | |
| HuH7细胞 | Procell | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 采样与生态区划分 | 采样地点、生态区划分依据（Köppen-Geiger气候分类）、采样时间范围（2021年6月至2024年3月） 阅读提示：Methods: Study sites and sample collection |
| 病毒组分析 | 测序平台、读长、RPM阈值、生物信息学流程（Trimmomatic、Bowtie2、MEGAHIT、Diamond等） 阅读提示：Methods: Library construction and virome analysis |
| 系统发育分析 | 参考序列获取、比对方法（ClustalW）、模型（GTR+G+I）、自举重复数（1000） 阅读提示：Methods: Phylogenetic analysis of viruses |
| 首尔病毒进化分析 | 序列分组（A-H）、分子钟模型（严格时钟）、MCMC运行参数（100百万迭代）、迁移事件BF阈值（>3） 阅读提示：Methods: Phylogenetic and evolutionary analysis of hantaviruses |
| 病毒增殖评估 | 细胞系来源（Procell）、MOI（1）、检测时间点（0-5 dpi）、定量PCR方法 阅读提示：Methods: Viral isolation and proliferative assessment |