小鼠模型建立与分组处理
建立他克莫司诱导的肾毒性小鼠模型，并评估不同干预措施的效果。
雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组（CON）、TAC、TAC+KYN、1-MT、TAC+Pemafibrate五组，分别给予相应处理8周，期间收集尿液、血液和肾脏组织用于后续分析。
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吲哚胺2,3-双加氧酶调控的巨噬细胞代谢重编程挽救他克莫司诱导的肾毒性
Indoleamine 2,3-dioxygenase-regulated macrophages metabolic reprogramming rescues tacrolimus-induced nephrotoxicity.
实验完整度
高包含体内小鼠模型和体外细胞模型，进行了代谢组学、Seahorse线粒体功能测定、巨噬细胞极化标志物检测和分子对接等验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠模型（TAC诱导肾毒性） iBMDM细胞系（永生化小鼠骨髓来源巨噬细胞） HEK293T细胞系（人胚肾上皮细胞） 小鼠原代肾巨噬细胞
重点核对
TAC剂量：2 mg/kg/day，腹腔注射，持续8周 KYN剂量：200 mg/kg，隔日腹腔注射 1-MT剂量：10 mg/kg/day，腹腔注射 Pemafibrate剂量：0.5 mg/kg/day，口服灌胃 体外处理：TAC（15 μM）、1-MT（200 μM）、KYN（100 μM）、pemafibrate（40 μM），处理24小时
摘要
巨噬细胞向M1表型的代谢重编程是肾损伤的关键病理特征。近期研究日益强调从头合成NAD+在肾损伤发展中的重要性。本研究发现，他克莫司（TAC）抑制吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）的活性，从而阻断色氨酸（Trp）向犬尿氨酸（KYN）的转化，损害从头合成NAD+。NAD+缺乏增强糖酵解，导致中长链脂肪酸和酰基肉碱积累，表明脂肪酸β-氧化受损，从而促进M1极化和加重肾损伤。进一步研究表明，通过外源性KYN补充恢复NAD+水平或直接激活过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）以增强脂肪酸氧化，均能有效逆转这种代谢失衡并减轻TAC诱导的肾损伤。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 他克莫司（TAC）如何通过影响IDO1和从头NAD+合成来诱导肾损伤，以及补充KYN或激活PPARα是否能挽救这种损伤？
- 核心机制
- TAC抑制IDO1表达和活性，减少色氨酸向犬尿氨酸的转化，导致从头NAD+合成减少，NAD+缺乏促进糖酵解并损害脂肪酸β-氧化，进而驱动巨噬细胞向M1极化，加重肾损伤。
- 主要证据
- 在C57BL/6J小鼠模型中，TAC处理导致肾皮质IDO1表达下降、KP代谢物（KYN、3-HK、3-HAA、NAD+）降低，脂肪酸β-氧化障碍（中长链脂肪酸和酰基肉碱积累）和M1巨噬细胞增加；补充KYN或激活PPARα可逆转这些变化并改善肾功能。
- 研究意义
- 本研究提出，通过补充从头NAD+合成前体KYN或增强脂肪酸氧化来恢复巨噬细胞代谢，可能为TAC诱导的肾损伤提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
代谢组学分析
检测TAC对肾皮质和血浆代谢物谱的影响，特别是色氨酸代谢和能量代谢。
采用非靶向代谢组学分析肾皮质，靶向代谢组学分析血浆、肾皮质和细胞中的色氨酸代谢物、脂肪酸和能量代谢中间体。
线粒体功能检测
评估TAC对肾脏细胞和巨噬细胞线粒体呼吸和糖酵解的影响。
使用Seahorse XF24分析仪测量肾皮质细胞和iBMDM在葡萄糖或棕榈酸作为底物时的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。
巨噬细胞极化分析
检测TAC和IDO1抑制对肾巨噬细胞M1/M2极化的影响。
通过免疫荧光染色检测肾皮质中CD68+CD86+（M1）和CD68+ARG1+（M2）细胞比例，并通过RT-qPCR检测M1和M2相关基因表达。
机制验证
验证TAC抑制IDO1的分子机制以及KYN和PPARα激活的作用。
通过Western blot和RT-qPCR检测IDO1、CPT1、CPT2、CACT的表达，分子对接分析TAC与IDO1的结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估线粒体功能
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 他克莫司 | MedChemExpress | HY-13756 |
| 犬尿氨酸 | Sigma-Aldrich | K8625 | |
| 1-甲基-D-色氨酸 | MedChemExpress | HY-107946 | |
| 培马贝特 | Selleck | S8655 | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Hifair® III 第一链cDNA合成预混液 | YEASEN | 11137ES10 | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| IDO1抗体 | Proteintech | 13268-1-AP | |
| CPT1抗体 | ABclonal | A5307 | |
| CPT2抗体 | Proteintech | 26555-1-AP | |
| CACT抗体 | ABclonal | A13956 | |
| β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 80713-1-RR | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (H+L) | ABclonal | SA00001-2 | |
| 代谢组学 | 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱系统 | Waters | -- |
| ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| 脂肪酸代谢组学 | 超高效液相色谱-串联质谱（QTRAP 5500） | AB Sciex | -- |
| ACQUITY BEH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| 能量代谢组学 | ACQUITY BEH Amide色谱柱 | Waters | -- |
| 肾巨噬细胞分离 | 小鼠F4/80阳性分选试剂盒 | Stemcell Technologies | -- |
| 线粒体功能 | Seahorse XF24细胞外流量分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| 免疫荧光染色 | CD68抗体 | Servicebio | -- |
| CD86抗体 | Servicebio | -- | |
| ARG1抗体 | Servicebio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 小鼠品系：C57BL/6J，雄性，8周龄；给药剂量：TAC 2 mg/kg/day i.p.，KYN 200 mg/kg隔日i.p.，1-MT 10 mg/kg/day i.p.，Pemafibrate 0.5 mg/kg/day i.p.；处理周期：8周 阅读提示：参见Methods 2.1和2.2 |
| 细胞实验 | 细胞系：iBMDM (M3-1001)和HEK293T (CL-0005)；培养条件：DMEM高糖+10% FBS+1% P/S；处理浓度：TAC 15 μM，1-MT 200 μM，KYN 100 μM，Pemafibrate 40 μM；处理时间：24小时 阅读提示：参见Methods 2.4 |
| 代谢组学分析 | 样本类型：血浆、肾皮质、细胞；仪器：UPLC-Q-TOF、UPLC-MS/MS；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3、ACQUITY BEH C18、ACQUITY BEH Amide；流动相和梯度条件详见原文 阅读提示：参见Methods 2.8-2.11 |
| 线粒体功能检测 | 仪器：Seahorse XF24；底物：葡萄糖25 mM或棕榈酸0.23 mM；注射药物：寡霉素1 μM，FCCP 2 μM，鱼藤酮/抗霉素A 1 μM；OCR归一化：总蛋白 阅读提示：参见Methods 2.13 |
| Western blot | 一抗：IDO1 (Proteintech 13268-1-AP)、CPT1 (ABclonal A5307)、CPT2 (Proteintech 26555-1-AP)、CACT (ABclonal A13956)、β-tubulin (Proteintech 80713-1-RR)；二抗：HRP标记的抗兔IgG；曝光：ECL 阅读提示：参见Methods 2.7 |