样品制备
制备L. plantarum FS4722的发酵上清液、热灭活菌悬液和细胞裂解物，用于后续抗炎活性评估。
将L. plantarum FS4722培养至9 log CFU/mL，离心收集上清液并过滤得到发酵上清液；在80°C水浴灭活30分钟得到热灭活菌悬液；超声破碎菌体并离心收集上清液得到细胞裂解物。
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植物乳杆菌FS4722通过MAPK和NF-κB信号通路的抗炎作用及其冻干优化
Anti-Inflammatory Effects of Lactiplantibacillus plantarum Strain FS4722 Through MAPK and NF-κB Signaling Pathways and Its Lyophilization Optimization.
实验完整度
高体外细胞模型验证抗炎功能，包含功能实验、机制验证（RT-qPCR、Western blot）以及冻干工艺优化与稳定性评估，多个证据层级。
主要模型
LPS刺激的RAW 264.7小鼠巨噬细胞
重点核对
LPS刺激浓度：1 μg/mL 样品处理浓度：FS4722-Fs为20% (v/v)，FS4722-Dbs和FS4722-Bl为9 log CFU/mL 预处理时间：2 h，刺激时间：24 h 冻干保护剂配方：10.00%海藻糖、1.00% CMC-Na、5.00%脱脂乳 储存条件：4°C，28天
摘要
益生菌在治疗和预防炎症性疾病方面具有巨大潜力；然而，其应用常因抗炎机制不明确和冻干后存活率降低而受限。本研究全面评估了植物乳杆菌FS4722（L. plantarum FS4722）的抗炎潜力，并通过优化冻干保护剂配方显著提高了菌株存活率。功能实验表明，源自L. plantarum FS4722的发酵上清液、热灭活菌悬液和细胞裂解物有效抑制了LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中炎症细胞因子的转录和表达。其中发酵上清液的抑制作用最强，超过了参考益生菌鼠李糖乳杆菌GG（LGG）。机制研究表明，其抗炎活性主要通过抑制MAPK和NF-κB信号通路介导。此外，通过成分筛选结合响应面法，优化了冻干保护剂配方（10.00%海藻糖、1.00%羧甲基纤维素钠和5.00%脱脂乳），冻干存活率达82.32%，同时保持了细胞完整性；在加速稳定性评估中，该菌株在4°C储存28天后仍保留78.89%的活性。总之，本研究为益生菌制剂提供了一种稳健高效的策略，同时系统阐明了潜在的抗炎机制，为高性能益生菌产品的开发和临床应用提供了实践指导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- L. plantarum FS4722的抗炎作用及其机制，以及如何通过优化冻干保护剂提高其冻干存活率和稳定性。
- 核心机制
- FS4722通过抑制MAPK和MyD88/NF-κB信号通路的激活（包括降低ERK1/2、JNK、p38的磷酸化，以及MyD88、IκB-α、p65的表达和磷酸化）来发挥抗炎作用。
- 主要证据
- 在LPS刺激的RAW 264.7细胞中，FS4722的发酵上清液、热灭活菌悬液和细胞裂解物显著抑制NO、PGE2、TNF-α、IL-6的产生，并上调IL-10；同时降低iNOS、COX-2等炎症基因表达。Western blot和RT-qPCR证实对MAPK和NF-κB通路的抑制。
- 研究意义
- 为L. plantarum FS4722为基础的抗炎产品的工业开发提供了理论和实践基础，并提示未来需鉴定活性化合物、在动物模型中验证功效以及评估长期功能性稳定性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞活力与NO抑制评估
评估三种样品对RAW 264.7细胞的细胞毒性以及抑制LPS诱导的NO产生的能力。
使用MTT法检测细胞活力，使用Griess试剂法检测NO产生。
炎症细胞因子表达分析
评估三种样品对LPS诱导的炎症细胞因子转录和蛋白表达的影响。
使用RT-qPCR检测iNOS、COX-2、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10的mRNA表达；使用ELISA检测PGE2、TNF-α、IL-6、IL-10的蛋白水平。
MAPK和NF-κB信号通路机制研究
探究FS4722抑制炎症反应的分子机制，验证对MAPK和MyD88/NF-κB信号通路的调控。
利用RT-qPCR检测MAPK和NF-κB通路相关基因的表达，利用Western blot检测相关蛋白的磷酸化水平。
冻干保护剂单因素筛选
筛选单一冻干保护剂对L. plantarum FS4722冻干存活率的影响。
分别测试不同浓度的羧甲基纤维素钠、乙酸钠、甘油、海藻糖、脱脂乳粉和蔗糖对冻干存活率的影响。
响应面法优化冻干保护剂配方
通过响应面法优化复合保护剂配方，以最大化冻干存活率。
使用Design-Expert软件进行Box-Behnken设计，考察脱脂乳粉、海藻糖和羧甲基纤维素钠的交互作用。
冻干粉末微观结构分析
评估冻干保护剂对L. plantarum FS4722细胞形态完整性的保护作用。
使用扫描电子显微镜观察冻干粉末的表面微观结构。
储存稳定性评估
评估优化后的冻干保护剂在4°C储存条件下对菌株活力的保护效果。
将冻干粉末在4°C储存28天，每7天取样并进行平板计数测定活菌数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | MRS肉汤 | BD Biosciences | -- |
| 样品制备 | Milli-Q超纯水净化系统 | Millipore | -- |
| 0.22 μm PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | -- | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液 | Gibco | -- | |
| 细胞活力检测 | MTT试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| NO检测 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| Griess试剂 | Beyotime | -- | |
| ELISA | PGE2 ELISA试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 小鼠IL-10 ELISA试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SensiFAST cDNA合成试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| SensiFAST SYBR No-ROX试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| Western blot | DC蛋白测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 冻干 | 海藻糖 | -- | -- |
| 羧甲基纤维素钠 | -- | -- | |
| 脱脂乳粉 | -- | -- | |
| 甘油 | -- | -- | |
| 蔗糖 | -- | -- | |
| 乙酸钠 | -- | -- | |
| SEM | S4800场发射扫描电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 储存稳定性 | WHIRL-PAK无菌取样袋 | Nasco | -- |
| 恒温培养箱（ICH110型） | Memmert | ICH110 | |
| 细胞培养 | 96孔板 | Corning | -- |
| 12孔板 | Corning | -- | |
| 6孔板 | Corning | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | RAW 264.7细胞系来源（武汉普诺赛），培养条件：DMEM高糖培养基+10% FBS+1%青霉素-链霉素，37°C，5% CO2 阅读提示：Materials and Methods: Section 2.3 |
| 样品制备 | L. plantarum FS4722培养条件（MRS肉汤，37°C，18h），发酵上清液制备（离心、过滤），热灭活条件（80°C，30min），细胞裂解液制备（超声破碎40kHz，15min） 阅读提示：Materials and Methods: Sections 2.1 and 2.2 |
| 细胞活力与NO检测 | MTT法测定细胞活力（2×10^5 cells/well，处理24h），NO产生测定（LPS刺激1 μg/mL，Griess试剂法） 阅读提示：Materials and Methods: Sections 2.4 and 2.5 |
| 炎症因子检测 | ELISA测定PGE2、IL-6、TNF-α、IL-10（细胞5×10^5 cells/well，处理2h，LPS刺激24h） 阅读提示：Materials and Methods: Section 2.6 |
| 信号通路验证 | RT-qPCR和Western blot检测MAPK和NF-κB通路相关基因和蛋白（细胞1×10^6 cells/well，处理2h，LPS刺激24h；蛋白上样20μg） 阅读提示：Materials and Methods: Section 2.8 |
| 冻干保护剂优化 | 单因素实验和响应面法优化保护剂配方，包括脱脂乳粉、海藻糖、CMC-Na浓度范围 阅读提示：Materials and Methods: Section 2.9; Figure 5; Tables S3-S5 |
| 储存稳定性 | 冻干粉末在4°C储存28天，定期取样平板计数 阅读提示：Materials and Methods: Section 2.11; Figure 7B |