Mechanism of arbutin in metabolic dysfunction-associated fatty liver disease based on multi-omics research.
包含体内动物模型、体外细胞模型、分子生物学验证（qPCR、Western blot、siRNA敲低）及多组学分析（16S rRNA测序、代谢组学）。
高脂饮食诱导的C57BL/6J小鼠MAFLD模型 游离脂肪酸诱导的AML12细胞MAFLD模型 GSE260666转录组数据队列（6例健康对照，5例MAFLD患者）
动物分组：Ctrl、HFD、HFD+ARB-L (10 mg/kg/day)、HFD+ARB-H (100 mg/kg/day)、HFD+Pio (5 mg/kg/day)，每组6只，干预12周 体外模型：AML12细胞，0.5 mM FFA (OA:PA=2:1)处理，ARB浓度0-125 μM，处理24小时 STAT3敲低：si-STAT3转染AML12细胞，验证敲低效率 分子对接：ARB与STAT3 (PDB ID: 3CWG)结合能-7.1 kcal/mol，氢键残基LYS244, LYS488, HIS454 16S rRNA测序：V3-V4区域，Illumina NovaSeq 6000平台
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估ARB对高脂饮食诱导的MAFLD小鼠的肝脏病理和治疗效果。
6周龄雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后随机分为5组（每组6只），包括正常对照、HFD、HFD+ARB低剂量（10 mg/kg/day）、HFD+ARB高剂量（100 mg/kg/day）、HFD+吡格列酮阳性对照（5 mg/kg/day），灌胃给药，持续12周。期间进行IPGTT（第8周）和ITT（第9周），每周记录体重。实验结束后麻醉采血、取肝和粪便样本。
在细胞水平验证ARB对游离脂肪酸诱导的肝细胞脂质蓄积的抑制作用。
AML12细胞培养于含10% FBS、胰岛素、转铁蛋白、硒、地塞米松和青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基。以0.5 mM游离脂肪酸（OA:PA=2:1）处理细胞，同时加入不同浓度的ARB（0-125 μM）处理24小时。油红O染色和CCK-8检测脂质蓄积和细胞活力。
预测ARB治疗MAFLD的潜在靶点和信号通路。
从GEO数据库获取GSE260666转录组数据，使用limma包进行差异表达分析，GSEA富集分析凋亡通路。通过SwissTargetPrediction、PharmMapper和SuperPred数据库预测ARB靶点，GeneCards获取MAFLD相关基因，取交集获得66个靶点。对交集基因进行GO和KEGG富集分析。
验证ARB是否直接结合STAT3蛋白。
使用CB-DOCK2进行分子对接，以ARB为配体，STAT3（PDB ID: 3CWG）为受体，计算结合能并分析氢键。CETSA实验：AML12细胞分为对照组和100 μM ARB处理组，加热温度梯度42-62°C，通过Western blot检测STAT3热稳定性变化。
在体内和体外验证ARB是否通过STAT3调控凋亡相关基因表达。
在小鼠肝脏和AML12细胞中，通过qPCR和Western blot检测凋亡相关基因（BCL2、BAX、caspase 3、STAT3、P-STAT3）的表达。使用si-STAT3敲低AML12细胞中STAT3，观察ARB对脂质蓄积和凋亡蛋白表达的影响。
分析ARB对MAFLD小鼠肠道菌群组成的影响。
提取小鼠粪便DNA，扩增16S rRNA V3-V4区，Illumina NovaSeq 6000测序。使用QIIME2进行ASV分析，LEfSe鉴定差异菌群。
分析ARB对MAFLD小鼠粪便代谢物谱的影响。
粪便样本经甲醇提取，使用UPLC-HRMS（Q Exactive Plus）分析，通过PCA、PLS-DA识别差异代谢物，并进行KEGG富集分析。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 熊果苷 | MedChemExpress | HY-N0192 |
| 高脂饲料 | Dyets | HF60 | |
| 动物麻醉 | 三溴乙醇 | Meilunbio | MB2548 |
| 生化检测 | 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| ALT和AST检测试剂盒 | Jiancheng | -- | |
| FFA检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 油酸 | Kunchuang Biotechnology | -- | |
| 棕榈酸 | Kunchuang Biotechnology | -- | |
| 细胞染色 | 油红O染色液 | Solarbio | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | NCM Biotech | -- |
| siRNA转染 | Lipo8000转染试剂 | Beyotime Biotechnology | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Beyotime Biotechnology | -- |
| RT-qPCR | 反转录试剂盒 | Takara Bio | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | KeyGENBioTECH | -- |
| PVDF膜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| β-actin抗体 | ABclonal | -- | |
| BAX抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| BCL2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Cleaved caspase 3抗体 | Zenbioscience | -- | |
| STAT3抗体 | Proteintech | -- | |
| P-STAT3抗体 | Proteintech | -- | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Cell Signaling Technology | -- | |
| ECL系统 | Beijing Sage Creation Science Co., Ltd. | -- | |
| 16S rRNA测序 | OMEGA土壤DNA提取试剂盒 | Omega Bio-Tek | D5635-02 |
| Agencourt AMPure XP试剂盒 | Beckman Coulter, Inc. | -- | |
| Quant-IT PicoGreen dsDNA检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NEbNext Ultra文库制备试剂盒 | New England Biolabs, Inc. | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina, Inc. | -- | |
| 代谢组学 | ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive™ Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立及给药 | 小鼠品系（C57BL/6J）、性别（雄性）、年龄（6周）、体重范围（16±2g）、饲养条件（12/12h光暗循环，自由进食） 阅读提示：Materials and methods：Establishment of the MAFLD animal model |
| 动物分组及干预 | 分组（Ctrl、HFD、HFD+ARB-L、HFD+ARB-H、HFD+Pio）、每组数量（6只）、给药剂量（ARB 10、100 mg/kg/day；Pio 5 mg/kg/day）、给药方式（灌胃）、干预时长（12周） 阅读提示：Materials and methods：Experimental design |
| 细胞模型建立及处理 | 细胞系（AML12）、培养基成分（DMEM/F12+10%FBS+胰岛素10μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、硒5ng/mL、地塞米松40ng/mL、青霉素/链霉素1%）、FFA浓度（0.5mM，OA:PA=2:1）、ARB浓度（0-125μM）、处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods：Establishing an in vitro model of MAFLD |
| STAT3敲低实验 | siRNA序列（si-STAT3: 5'-CCUGAGUUGAAUUAUCAGCUU-3'）、转染试剂（Lipo8000）、转染时间（48小时） 阅读提示：Materials and methods：Small interfering RNA (siRNA) construction and transfection |
| 分子对接条件 | 蛋白质结构（STAT3 PDB ID: 3CWG）、对接软件（CB-DOCK2）、结合能（-7.1 kcal/mol） 阅读提示：Results：STAT3 as a target of ARB |
