生存分析和单细胞功能状态分析
评估SERPINE1表达对不同癌症患者预后的影响及其与细胞功能状态的相关性。
使用GEPIA2和TCGA数据生成Kaplan-Meier生存曲线，使用CancerSEA数据库进行单细胞功能状态相关性分析。
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SERPINE1在调控细胞增殖和侵袭中的多重作用
Diverse roles of SERPINE1 in regulating cellular proliferation and invasion.
实验完整度
高包含体外细胞实验、异种移植瘤模型、肺转移模型、RNA-seq等组学分析及功能验证和机制探讨。
主要模型
MDA-MB-231人乳腺癌细胞系 H4人胶质瘤细胞系 C918人黑色素瘤细胞系 BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤和肺转移模型
重点核对
SERPINE1敲低用两种shRNA（shSE1）及对照shc，靶序列：5'-AGACCAACAAGTTCAACTATA-3'和5'-TCTCTGCCCTCACCAACATTC-3' MDA-MB-231、C918细胞用于体内实验：皮下注射5×10^6细胞（n=5）和尾静脉注射1×10^4细胞（n=6） 细胞系MDA-MB-231、H4、C918经STR鉴定且无支原体污染 SERPINE1敲低后稳定筛选用嘌呤霉素4μg/ml作用14天 RNA-seq使用每组一个生物学重复
摘要
丝氨酸蛋白酶抑制剂进化枝E成员1（SERPINE1）参与多种生物学过程，但其在促进或抑制肿瘤发生中的作用仍存争议。本研究聚焦于SERPINE1下调对三种类型肿瘤细胞增殖和侵袭的影响，以阐明其潜在机制。基于癌症基因组图谱数据集的分析，乳腺癌和低级别胶质瘤患者中SERPINE1高表达与不良预后相关，而皮肤皮肤黑色素瘤患者中SERPINE1表达升高与较好结局相关。在细胞增殖表型方面，SERPINE1敲低通过调节微小染色体维持复合体组分3和p53/SMAD3调节因子活性，促进细胞周期进程，从而增加黑色素瘤C918细胞的异种移植瘤生长和增殖；相反，SERPINE1敲低通过降低尿激酶型纤溶酶原激活物受体介导的ERK/p38活性比率，减少MDA-MB-231乳腺癌细胞的异种移植瘤生长和增殖，并类似地通过热休克蛋白90-α（HSP90α）介导的ERK/p38活性比率降低，减少H4胶质瘤细胞的增殖。关于侵袭和转移，SERPINE1敲低在C918和MDA-MB-231细胞中一致地减少侵袭、基质金属蛋白酶（MMP）活性和肺转移，但在H4细胞中却通过HSP90α-p38-MMP-1轴矛盾地增加侵袭和MMP-1活性。总之，这些发现表明SERPINE1通过多种调控机制对细胞增殖和侵袭发挥不同作用。这些发现表明，靶向SERPINE1的治疗需要全面理解其功能的多样机制，可以提高治疗精准度并减少不良反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SERPINE1在不同肿瘤类型中如何差异化调控细胞增殖和侵袭？
- 核心机制
- SERPINE1敲低在C918细胞中通过降低TGF-β水平，抑制p53和SMAD3活性，促进细胞周期进展；在231和H4细胞中分别通过uPAR和HSP90α介导降低ERK/p38活性比率，诱导失巢凋亡；在H4细胞中通过HSP90α-p38轴上调MMP-1表达促进侵袭。
- 主要证据
- 体外细胞增殖实验（克隆形成、CCK-8）、细胞周期流式分析、蛋白阵列、Western blot、Transwell迁移和侵袭实验、MMP活性检测、体内异种移植瘤和肺转移模型、RNA-seq和生物信息学分析。
- 研究意义
- 有助于理解SERPINE1在不同肿瘤中的复杂功能，为开发精准的SERPINE1靶向治疗策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞系选择和SERPINE1敲低
建立SERPINE1敲低的细胞模型并验证敲低效率。
在MDA-MB-231、H4、C918细胞中用慢病毒载体表达shSE1或shc，通过Western blot、mRNA和ELISA验证敲低效率。
体外增殖和体内肿瘤生长实验
评估SERPINE1敲低对细胞增殖和肿瘤生长的影响。
进行克隆形成实验和CCK-8增殖实验；建立皮下异种移植瘤模型，测量肿瘤体积和重量。
细胞周期和机制分析
探究SERPINE1敲低影响增殖的分子机制，特别是细胞周期相关蛋白和信号通路。
进行RNA-seq分析差异表达基因，GO/KEGG富集分析和GSEA；用流式细胞术检测细胞周期；使用蛋白阵列和Western blot检测相关蛋白表达。
信号通路干预实验
验证uPAR和HSP90α在SERPINE1敲低调控ERK/p38信号中的作用。
在231-shSE1细胞中过表达uPAR（ex-PLAUR），在H4-shSE1细胞中敲低HSP90AA1（si-HSP90AA1），检测ERK/p38活性和细胞增殖。
失巢凋亡检测
评估SERPINE1敲低对悬浮培养细胞失巢凋亡的影响。
使用poly-HEMA涂层培养板诱导失巢凋亡，用Annexin V-APC/DAPI染色流式检测凋亡。
细胞迁移和侵袭实验
评估SERPINE1敲低对细胞迁移和侵袭能力的影响。
使用Transwell小室进行迁移和侵袭实验，基质胶或I型胶原包被，计数穿过膜的细胞。
MMP活性检测
分析SERPINE1敲低对MMP和TIMP表达及活性的影响。
使用MMP抗体芯片检测MMP/TIMP水平，使用荧光法检测MMP-1和MMP-13活性。
动物体内转移实验
在体内验证SERPINE1敲低对肺转移的影响。
通过尾静脉注射细胞建立肺转移模型，4周后评估肺转移灶。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
生存分析
单细胞功能分析
细胞迁移和侵袭分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Jiangsu KeyGen Biotech Co., Ltd. | KGL1206-500 |
| 胎牛血清 | Pricella | 164210 | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lenti-Pac HIV表达包装试剂盒 | GeneCopoeia, Inc. | LT001 |
| 嘌呤霉素 | MedChemExpress | HY-B1743 | |
| G418 | MedChemExpress | HY-17561 | |
| RNA干扰 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| siRNA阴性对照 | MedChemExpress | HY-RS06415 | |
| ELISA | 人SERPINE1 ELISA试剂盒 | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | EH0538 |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | R0020 |
| 二硫苏糖醇 | MedChemExpress | HY-15917 | |
| 蛋白激酶抑制剂 | Beyotime Biotechnology | P1006 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | PC0020 | |
| SDS-PAGE梯度凝胶 | ACE Biotechnology | ET15420L | |
| PVDF膜 | Merck Sharp & Dohme-Hoddesdon | ISEQ00010 | |
| 脱脂牛奶 | Beyotime Biotechnology | P0216 | |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime Biotechnology | NGP0028A | |
| 抗SERPINE1抗体 | Proteintech Group, Inc | 13801-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-25778 | |
| 抗MCM3抗体 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PA5-79646 | |
| 抗磷酸化MCM3 (Ser112)抗体 | Abmart Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | TA2362 | |
| 抗ERK抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-514302 | |
| 抗uPAR抗体 | Abcam | ab10379 | |
| 抗Histone H3抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 4499 | |
| 抗磷酸化p53 (Ser15)抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9284 | |
| 抗p53抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 2524 | |
| 抗磷酸化SMAD3 (Ser423/425)抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9520 | |
| 抗SMAD3抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9523 | |
| 抗磷酸化Rb (Ser807/811)抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 8516 | |
| 抗Rb抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9309 | |
| 抗CyclinD1抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 55506 | |
| 抗CyclinE1抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 20808 | |
| 抗p21抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 2947 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 4511 | |
| 抗p38抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 8690 | |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 4370 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9255 | |
| 抗JNK抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9252 | |
| 抗磷酸化AKT (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 4060 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9272 | |
| 抗HSP90α抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 4877 | |
| 抗MMP-1抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 54376 | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2301 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd. | ZB-2305 | |
| WesternBright ECL HRP底物 | Advansta Inc. | R-03031-D2 | |
| C-DiGit成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 细胞周期检测 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 核糖核酸酶A | Elabscience | E-CK-A351 | |
| 细胞周期相关蛋白抗体芯片 | RayBiotech, Inc. | AAH-BLG-CYC-4 | |
| 细胞处理 | 重组人TGF-β1 | MedChemExpress | HY-P70543 |
| 溶剂对照 | -- | -- | |
| 失巢凋亡诱导 | 聚甲基丙烯酸羟乙酯 | MilliporeSigma | P3932 |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC/DAPI凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A258 |
| 迁移和侵袭实验 | Transwell小室 | Wuhan NEST Biotechnology Co., Ltd. | 725321 |
| 侵袭实验 | 基质胶 | Xiamen Mogengel Biotechnology Co., Ltd. | 0827045 |
| I型胶原 | MilliporeSigma | 08-115 | |
| MMP分析 | 人MMP抗体芯片 | RayBiotech, Inc. | QAH-MMP-1-1 |
| MMP活性检测 | MMP-1活性检测试剂盒 | GENMED | GMS50069.1.v.A |
| MMP-13活性检测试剂盒 | GENMED | GMS50076.1.v.A | |
| RNA-seq | Trizol试剂 | Beyotime Biotechnology | R0016 |
| RNA 6000 Nano LabChip试剂盒 | Agilent Technologies, Inc. | 5067-1511 | |
| Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent Technologies, Inc. | -- | |
| Dynabeads Oligo (dT)磁珠 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| RNA片段化模块 | New England BioLabs, Inc. | e6150 | |
| SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1896649 | |
| 大肠杆菌DNA聚合酶I | New England BioLabs, Inc. | m0209 | |
| 核糖核酸酶H | New England BioLabs, Inc. | m0297 | |
| dUTP溶液 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | R0133 | |
| 热敏感UDG酶 | New England BioLabs, Inc. | m0280 | |
| Qubit双链DNA高灵敏度定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系（MDA-MB-231、H4、C918）来源（Peking Union Medical College），培养基（DMEM添加10%FBS和1%青霉素/链霉素），慢病毒MOI=3，嘌呤霉素4μg/ml或G418 800μg/ml筛选14天 阅读提示：Methods: Cell lines and cell culture; Cell transfection |
| SERPINE1敲低与恢复 | shRNA靶序列（Target1: 5'-AGACCAACAAGTTCAACTATA-3'; Target2: 5'-TCTCTGCCCTCACCAACATTC-3'），shRNA-resistant SERPINE1 cDNA（六处同义突变），对照shc序列 阅读提示：Methods: Cell transfection |
| 增殖与体内实验 | 克隆形成实验（1×10^3细胞/孔，14天），皮下异种移植瘤（5×10^6细胞，4周龄裸鼠，n=5），肺转移模型（1×10^4细胞，尾静脉，6周龄裸鼠，n=6），肿瘤体积计算公式 阅读提示：Methods: Clonogenic assays; Tumorigenicity; Figure 2 |
| 细胞周期与信号通路检测 | 细胞周期检测（PI染色，流式），RIPA裂解液成分，Western blot抗体列表和稀释度，外源TGF-β1浓度（0.5 ng/ml）和处理时间（24小时） 阅读提示：Methods: Detection of cell cycle...; Western blotting; Results: SERPINE1-mediated cell cycle regulation |
| 迁移和侵袭实验 | Transwell迁移（1×10^4细胞/孔，24小时），侵袭实验（4×10^4细胞/孔，基质胶或胶原I包被，48小时），每组三个重复 阅读提示：Methods: Migration and invasion assays; Figure 5 |
| MMP活性检测 | MMP数组（QAH-MMP-1-1，四重复），MMP-1和MMP-13活性荧光法（GENMED，三重复） 阅读提示：Methods: Analysis of the MMP array; Fluorescence-based MMP activity assays |
| 动物实验伦理 | 动物品系（BALB/c nu/nu小鼠），来源，伦理批准号（TMUaMEC 2022045） 阅读提示：Methods: Tumorigenicity; Ethics approval |