单细胞图谱构建与棕榈酰化状态鉴定
描绘胃癌微环境的细胞组成，并基于CHPF算法对细胞进行棕榈酰化高低分类。
整合来自25个胃肿瘤的119,931个细胞的scRNA-seq数据，使用UMAP聚类识别八大细胞类型，通过InferCNV和CopyKAT区分恶性上皮细胞，并应用CHPF计算每个细胞的棕榈酰化评分，以>2.5为阈值划分P-high和P-low。
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AI驱动的单细胞解析棕榈酰化景观揭示胃癌多细胞预后程序
AI-enabled single-cell dissection of the palmitoylation landscape identifies a multicellular prognostic program in gastric cancer.
实验完整度
高研究包含单细胞转录组、空间转录组、批量队列分析以及体外功能实验和体内异种移植等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
胃癌细胞系（AGS、BGC823、NCI-N87、HGC-27） 永生化胃黏膜细胞系GES-1 NOD-scid小鼠皮下异种移植模型 胃癌患者肿瘤组织样本
重点核对
单细胞RNA-seq数据来自25个胃肿瘤，119,931个细胞 空间转录组包含10个GC切片（GSE251950） BGC823和AGS细胞用于功能实验，分别敲低和过表达SH3BGRL 皮下异种移植模型使用NOD-scid小鼠，每组5只，注射5×10^6细胞 风险评分截断值1.34，在TCGA训练集中确定
摘要
胃癌症仍然高度致命，但蛋白质S-棕榈酰化如何塑造肿瘤生态系统和临床结果尚不清楚。我们整合了单细胞RNA测序（来自25个胃肿瘤的119,931个细胞）与空间转录组学和批量队列，描绘了恶性、免疫和基质区室中棕榈酰化相关的状态。一个高棕榈酰化恶性程序被分为三个富集转移的亚群，这些亚群具有增强的脂肪酸代谢和Ras–MAPK信号传导，并预测更差的生存率。空间定位和配体-受体推断揭示了共定位的生态位，其中高棕榈酰化肿瘤细胞与免疫抑制性髓系细胞和不同的CAF亚群相互作用，增强了促血管生成和促纤维化信号。我们推导并验证了一个87基因的多细胞棕榈酰化特征用于风险分层，较高的评分与外部队列中的不良结果一致相关。药物反应建模突出了涉及HSP90–PI3K/MAPK轴的脆弱性。功能实验和异种移植证实SH3BGRL是该预后不良程序中的关键驱动因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蛋白质S-棕榈酰化如何影响胃癌的肿瘤生态系统和临床结局？
- 核心机制
- 高棕榈酰化肿瘤细胞通过脂肪酸代谢和Ras-MAPK信号通路驱动转移，并形成AP-1/TEAD4驱动的非经典高侵袭/高凋亡表型，同时通过SPP1-CD44等免疫抑制轴与免疫抑制性髓系细胞和CAF相互作用，促进免疫逃逸和血管生成。
- 主要证据
- 单细胞转录组分析显示高棕榈酰化恶性细胞在转移性肿瘤中富集；体外功能实验表明SH3BGRL敲低抑制增殖、侵袭和克隆形成，促进凋亡，而过表达则相反；体内异种移植实验证实SH3BGRL敲低延缓肿瘤生长。
- 研究意义
- 该研究提供了胃癌中棕榈酰化相关程序的多细胞图谱，并提出了可靶向的脆弱性，如CDC37-HSP90和PI3K/MAPK通路，为精准预后和治疗提供了潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
恶性上皮亚聚类及通路富集分析
解析高棕榈酰化恶性细胞亚群的功能特征和富集通路。
对恶性上皮细胞重新聚类，基于CHPF评分分为P-high和P-low亚群，P-high分为P1-P3，P-low分为N1-N6。比较各亚群的基因表达，通过WGCNA识别模块，并进行GO和KEGG富集分析。
转录因子网络构建与表型关联
揭示P-high细胞中驱动侵袭和凋亡表型的转录因子网络。
使用SCENIC分析P1-P3与N3的转录因子网络，识别FOSL1、JUNB、STAT3和TEAD4为hub TF，并与Hallmark通路进行相关性分析。
预后特征构建与验证
开发并验证基于棕榈酰化高表达的预后风险特征。
使用TCGA训练集进行单变量Cox回归，筛选87个与生存相关的P-high特异性基因，通过101种机器学习模型评估，选择Ridge回归模型（λ=0.032），确定最优截断值，并在GEO和TCGA外部队列中验证。
多组学特征分析
揭示高风险P-high肿瘤的基因组、表观遗传和蛋白质组学特征。
使用全外显子组、甲基化阵列和蛋白质组学分析高风险vs低风险组的差异，发现TP53、KRAS突变、TMB升高、全球低甲基化以及EGFR-AKT-STAT3磷酸化升高。
药物敏感性预测
识别P-high肿瘤细胞的潜在治疗靶点。
将P-high特异性基因与GDSC药物反应数据关联，并采用CMap分析，预测对CDC37抑制剂（celastrol）、HSP90抑制剂（luminespib）、PI3K/mTOR抑制剂（dactolisib）、MEK抑制剂（trametinib）等药物的敏感性。
细胞间通讯分析
描绘P-high肿瘤细胞与免疫和基质细胞间的配体-受体相互作用网络。
使用CellChat分析P-high与P-low细胞间的相互作用，揭示SPP1-CD44、GAS6-AXL等免疫抑制轴，以及MDK-NCL等促纤维化轴，并通过空间转录组验证共定位。
SH3BGRL功能验证
验证SH3BGRL在胃癌恶性表型中的功能作用。
在BGC823细胞中敲低SH3BGRL，在AGS细胞中过表达，通过CCK-8、克隆形成、流式凋亡、Transwell侵袭迁移和Western blot评估细胞增殖、凋亡、侵袭和EMT标志物，并通过皮下异种移植实验评估体内肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 分子克隆 | pLKO.1-puro载体 | -- | -- |
| LV5-puro慢病毒载体 | GenePharma | -- | |
| 细胞培养 | 293T细胞 | -- | -- |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Green预混液 | Accurate Biology | -- | |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞增殖实验 | CCK-8细胞增殖试剂盒 | Dojindo | -- |
| 细胞凋亡分析 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 细胞侵袭迁移实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| SH3BGRL抗体 | Proteintech | Cat#11253-1-AP | |
| E-cadherin抗体 | Proteintech | Cat#20874-1-AP | |
| Vimentin抗体 | Proteintech | Cat#10366-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | Cat#60004-1-Ig | |
| ECL检测试剂盒 | Millipore | -- | |
| 免疫组织化学 | Ki-67抗体 | Proteintech | Cat#27309-1-AP |
| TUNEL染色 | TUNEL检测试剂盒 | Roche | -- |
| 动物实验 | 三溴乙醇 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA-seq数据预处理 | 细胞数量：119,931；样本数：25；参考基因组：GRCh38；QC阈值：线粒体>20%，血红蛋白>3%，UMI<200或>25,000，基因<200或>8,000；批次效应校正方法：Harmony；聚类参数：PCA top 30，分辨率0.8；随机种子：1234 阅读提示：Methods: Single-cell and spatial transcriptomic data |
| 棕榈酰化状态判定 | PAG基因集（187个）；CHPF阈值：>2.5；lambda值：0.032；截断值确定方法 阅读提示：Methods: Palmitoylation-state calling in single cells |
| 预后模型构建 | 训练集：TCGA-STAD；外部验证集：GEO五套数据；机器学习模型：Ridge回归，λ=0.032；截断值：1.34；基因数量：87 阅读提示：Methods: Prognostic model construction and Survival-model validation |
| SH3BGRL功能实验 | 细胞系：BGC823 (KD), AGS (OE)；shRNA靶点序列；过表达载体：LV5-puro；嘌呤霉素浓度：2 μg/mL；处理时间：10天；CCK-8细胞数：2000/孔；Transwell细胞数：5×10^4；侵袭实验需Matrigel；Western blot抗体信息及稀释比例 阅读提示：Methods: Functional Validation Experiments for SH3BGRL |
| 动物实验 | 小鼠品系：NOD-scid；周龄：6周；性别：雄性；细胞数：5×10^6；注射体积：100 μL；基质胶比例：1:1；每组5只；肿瘤测量间隔：3天；处死方式：1.25%三溴乙醇腹腔注射 阅读提示：Methods: Mouse Xenograft Model |