筛选和验证ANXA2P1在胃癌中的表达
鉴定与胃癌相关的糖酵解相关假基因，并验证其在胃癌组织中的表达。
对低糖和正常糖培养的AGS细胞进行微阵列分析，结合GSE122401和dreamBase数据取交集，筛选出ANXA2P1等9个上调假基因；在40对和80对胃癌及配对正常组织中进行RT-qPCR验证表达；利用TCGA数据库进行生存分析。
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ANXA2P1-hnRNP F-HK2/c-Myc正反馈环路促进胃癌增殖和糖酵解代谢
The ANXA2P1-hnRNP F-HK2/c-Myc Positive Feedback Loop Promotes Proliferation and Glycolytic Metabolism in Gastric Cancer.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内异种移植瘤模型、临床样本检测以及分子机制验证（RNA pull-down、RIP、ChIP、报告基因等），证据层级多元。
主要模型
胃癌细胞系（AGS， MKN-45， HGC-27， MKN-74等） 正常胃上皮细胞系GES-1 皮下异种移植瘤模型（BALB/c裸鼠） 胃癌患者组织样本（80对及30对）
重点核对
胃癌细胞系AGS和MKN-45用于ANXA2P1敲低（CRISPRi）实验 葡萄糖饥饿处理：低糖培养基（1 mM）处理0、6、12、24小时 体内实验：MKN-74细胞皮下注射5×10^6细胞至裸鼠，2-DG给药（500 mg/kg，隔天一次，持续两周） 体外实验重复三次（triplicate）
摘要
假基因来源的长链非编码RNA（lncRNAs）有助于肿瘤发生。然而，假基因ANXA2P1在胃癌（GC）生长和葡萄糖代谢中的作用仍不清楚。微阵列和RNA测序（RNA-seq）分析显示，在葡萄糖饥饿条件下GC细胞中ANXA2P1表达增加，并且在GC中表达升高。此外，ANXA2P1过表达通过增强有氧糖酵解促进增殖和转移。机制上，ANXA2P1结合RNA结合蛋白hnRNP F，并促进HK2近端多聚腺苷酸化位点的使用，从而产生具有增强稳定性的短3'UTR异构体。因此，升高的HK2表达加速GC增殖和代谢重编程。有趣的是，HK2通过作为转录因子c-Myc的共激活因子发挥非代谢作用，协同驱动ANXA2P1表达。临床上，与匹配的正常胃黏膜相比，GC患者标本中ANXA2P1、hnRNP F、HK2和c-Myc均升高。本研究说明ANXA2P1被视为癌基因，ANXA2P1-hnRNP F-HK2/c-Myc正反馈环路可能作为GC的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ANXA2P1在胃癌生长和葡萄糖代谢中的作用及机制是什么？
- 核心机制
- ANXA2P1与hnRNP F结合，促进HK2近端多聚腺苷酸化位点使用，产生稳定短3'UTR异构体，上调HK2表达；HK2与c-Myc形成复合物转录激活ANXA2P1，构成正反馈环路。
- 主要证据
- 微阵列和RNA-seq分析显示ANXA2P1在胃癌中上调；RNA pull-down和RIP证明ANXA2P1与hnRNP F结合；3'RACE和RHAPA证实HK2 3'UTR缩短；ChIP和报告基因证明c-Myc/HK2结合ANXA2P1启动子；体内外实验显示ANXA2P1促进增殖和糖酵解。
- 研究意义
- ANXA2P1-hnRNP F-HK2/c-Myc正反馈环路可能作为胃癌的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ANXA2P1对胃癌细胞增殖和迁移的影响
评估ANXA2P1对胃癌细胞生长和转移的生物学功能。
在低表达ANXA2P1的HGC-27和MKN-74细胞中过表达，在高表达的MKN-45和AGS细胞中用CRISPRi敲低，然后进行CCK-8、集落形成、细胞周期、Transwell迁移侵袭和划痕实验。
ANXA2P1对糖酵解的影响（体外和体内）
验证ANXA2P1是否促进胃癌细胞的有氧糖酵解。
在过表达或敲低ANXA2P1的细胞中检测葡萄糖摄取、乳酸生成、2-NBDG摄取和ECAR；体内将MKN-74过表达细胞注射裸鼠，并用2-DG处理，测量肿瘤体积，进行IHC检测Ki-67和HK2。
鉴定ANXA2P1相互作用蛋白
寻找ANXA2P1在胃癌细胞中发挥功能所结合的蛋白。
RNA pull-down结合质谱鉴定ANXA2P1结合蛋白，通过GO富集分析聚焦RNA结合蛋白，候选蛋白用RNA pull-down和RIP验证，最终锁定hnRNP F。
验证ANXA2P1与hnRNP F的结合结构域
确定ANXA2P1与hnRNP F相互作用的区域。
构建ANXA2P1截短体进行RNA pull-down，确定结合区域在1-900 nt；构建hnRNP F全长和截短体进行RIP，确定qRRM3结构域（289-366 aa）为结合必需。
探究ANXA2P1与hnRNP F协同促进增殖和糖酵解
验证ANXA2P1的功能是否依赖于hnRNP F。
在ANXA2P1过表达的细胞中敲低hnRNP F，检测增殖、集落形成、葡萄糖摄取、乳酸生成和ECAR；体内实验中，用AGS细胞（对照、ANXA2P1过表达、ANXA2P1过表达+hnRNP F敲低）注射裸鼠，观察肿瘤生长。
鉴定HK2为ANXA2P1/hnRNP F的靶基因
确定ANXA2P1和hnRNP F调控糖酵解的具体下游靶分子。
对ANXA2P1敲低细胞进行RNA-seq，对hnRNP F RIP进行RIP-seq，与KEGG糖酵解基因取交集，得到HK2；通过RIP验证hnRNP F结合HK2 mRNA，RAP验证ANXA2P1结合HK2 3'UTR。
验证hnRNP F和ANXA2P1对HK2表达的调控
检测hnRNP F和ANXA2P1对HK2 mRNA和蛋白水平的影响，以及是否是转录后调控。
过表达或敲低hnRNP F或ANXA2P1，检测HK2 mRNA和蛋白水平；检测HK2 pre-mRNA水平以排除转录调控。
研究HK2 mRNA稳定性调控机制
阐明ANXA2P1和hnRNP F如何稳定HK2 mRNA。
进行放线菌素D实验检测mRNA半衰期；用3'RACE和RHAPA分析HK2 3'UTR异构体；用报告基因检测短3'UTR对荧光素酶活性的影响。
验证HK2过表达挽救ANXA2P1和hnRNP F敲低的表型
证明HK2是ANXA2P1和hnRNP F促进增殖和糖酵解的关键下游效应分子。
在ANXA2P1敲低和/或hnRNP F敲低的细胞中过表达HK2，检测增殖、葡萄糖摄取、乳酸生成和ECAR。
鉴定调控ANXA2P1的转录因子
寻找转录因子，探索ANXA2P1的转录调控机制。
整合BioGRID HK2相互作用蛋白和微阵列差异表达转录因子，筛选出IRF7和c-Myc；敲低和过表达验证c-Myc正调控ANXA2P1。
验证c-Myc和HK2复合物结合ANXA2P1启动子
证明c-Myc/HK2复合物直接结合ANXA2P1启动子并激活转录。
DNA pull-down和ChIP检测c-Myc结合ANXA2P1启动子；Co-IP验证c-Myc和HK2相互作用；Re-ChIP验证两者共结合；报告基因实验检测c-Myc和HK2对启动子活性的影响。
验证c-Myc/HK2复合物对ANXA2P1功能的影响
验证c-Myc/HK2复合物通过调控ANXA2P1影响胃癌生长和糖酵解。
分组实验，敲低c-Myc和HK2，过表达ANXA2P1，检测细胞增殖和糖酵解指标；体内异种移植瘤实验验证。
临床样本相关性分析
验证ANXA2P1、hnRNP F、HK2和c-Myc在胃癌中的表达及临床相关性。
在80对胃癌和正常组织中检测hnRNP F、HK2、c-Myc的表达，分析其与临床病理参数的关系；通过ISH和IHC在30对样本中检测四种分子的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Ham's F-12K培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| D-葡萄糖 | Gibco | -- | |
| 葡萄糖摄取检测 | 2-NBDG | Invitrogen | -- |
| 糖酵解抑制 | 2-脱氧-D-葡萄糖 | Sigma | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA质量检测 | NanoDrop ND-2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 微阵列分析 | 花青素-3-CTP | -- | -- |
| Agilent G2505C扫描仪 | Agilent Technologies | -- | |
| RT-qPCR | 逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- |
| SYBR Green PCR试剂盒 | Takara | -- | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 细胞组分分离 | 胞质和核RNA纯化试剂盒 | Norgen Biotek Corporation | -- |
| ISH | DIG标记探针 | Boster | -- |
| NBT/BCIP显色底物 | Sigma | -- | |
| IHC | DAB显色底物 | ZSGB-BIO | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Beyotime | -- | |
| Tanon 4800成像系统 | Tanon | -- | |
| 质粒构建 | 质粒 | Kidan Biosciences | -- |
| 基因敲低 | 短发夹RNA | GenePharma | -- |
| CRISPRi | dCas9/KRAB及sgRNA慢病毒 | Genechem | -- |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | Yeasen | -- |
| 细胞周期 | 细胞周期检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| Beckman流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 迁移/侵袭 | Transwell小室 | Corning | -- |
| Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| 葡萄糖摄取 | 葡萄糖检测试剂盒 | Abbkine | -- |
| 乳酸生成 | 乳酸检测试剂盒 | Abbkine | -- |
| 流式分析 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| ECAR | Seahorse XF96细胞外通量分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| RNA pull-down | RNA pull-down试剂盒 | BersinBio | -- |
| RNAmax-T7体外转录试剂 | RiboBio | -- | |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Merck Millipore | -- |
| RNA测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| RAP | RAP试剂盒 | BersinBio | -- |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| GloMax发光检测仪 | Promega | -- | |
| 3'RACE | 3'RACE核心试剂盒 | Takara | 6106 |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和葡萄糖饥饿 | 细胞系来源（AGS等），培养条件（10%FBS，37℃，5%CO₂），葡萄糖饥饿使用1 mM葡萄糖培养基，处理时间（0、6、12、24小时） 阅读提示：Materials and Methods 细胞培养部分 |
| ANXA2P1表达验证 | ANXA2P1在胃癌组织和细胞中的表达水平，RT-qPCR内参（B2M），ISH和亚细胞定位结果 阅读提示：Results 第一小节及图1 |
| 功能实验（增殖、迁移、侵袭） | 细胞系（HGC-27、MKN-74、MKN-45、AGS），过表达和敲低方法（慢病毒和CRISPRi），CCK-8和集落形成实验条件，Transwell和划痕实验条件 阅读提示：Results 第二小节及补充图S2-S3 |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖摄取和乳酸检测方法，2-NBDG浓度，ECAR测定条件（葡萄糖、寡霉素、2-DG浓度） 阅读提示：Results 第三小节及图2 |
| RNA结合蛋白鉴定 | RNA pull-down和质谱条件，RIP验证，hnRNP F抗体，ANXA2P1截短体构建 阅读提示：Results 第四小节及图3 |
| HK2靶基因验证 | RNA-seq和RIP-seq方法，ANXA2P1敲低细胞，KEGG数据库取交集，RAP和蛋白酶K处理 阅读提示：Results 第五小节及图4 |
| mRNA稳定性实验 | 放线菌素D浓度（10 μg/mL）和处理时间，mRNA半衰期计算方法 阅读提示：Results 第六小节及图5B-D |
| 3'UTR异构体分析 | 3'RACE和RHAPA实验条件，短和长3'UTR报告基因构建，荧光素酶活性检测 阅读提示：Results 第六小节及图5E-H |
| 转录调控实验 | c-Myc和HK2过表达/敲低方法，ChIP和Re-ChIP条件，报告基因实验（启动子突变位点：+110~+117 突变从CCAAGTGC到ACGAATAC） 阅读提示：Results 第七小节及图6 |
| 体内异种移植实验 | 小鼠品系和年龄（BALB/c裸鼠，4-6周龄），注射细胞数和体积（5×10⁶ cells，0.1 mL），2-DG剂量（500 mg/kg）和给药方案（隔天一次，两周），肿瘤测量时间 阅读提示：Results 第三、四、七小节及图2F、3K、S11 |
| 临床样本分析 | 胃癌组织样本数量（80对和30对），ISH和IHC方法，临床病理参数相关性分析（包括分期、转移） 阅读提示：Results 第九小节及图7 |