仿生拓扑微图案阵列的制备以诱导成纤维细胞的各向异性/各向同性取向

Fabrication of biomimetic topological micropattern arrays to induce anisotropic/isotropic orientation of fibroblast.

作者信息Ping Yang, Xinglong Zhu, Yi Li, Hehan Feng, Yang Deng, Yanyan Zhou, Mumin Shao, Ji Bao
PMID41994169
期刊MethodsX
发布时间2026-02-16
DOI10.1016/j.mex.2026.103832

实验完整度

中

实验包含微图案芯片制备、细胞培养、F-肌动蛋白染色与FFT分析、免疫荧光染色等步骤,但仅有体外细胞实验,缺乏功能验证和体内机制验证。

主要模型

MRC-5人肺成纤维细胞系 巴马小型猪肺脱细胞ECM支架

重点核对

微图案形状与尺寸:矩形(300×50 μm)和正方形(300×300 μm) 微图案间距:50 μm 细胞接种密度:1×10^5 MRC-5细胞每芯片 细胞培养时间:3天

摘要

在成纤维细胞激活过程中,成纤维细胞表现出显著的异质性,其特征是具有独特分子标记和特殊功能的不同亚型。在癌症和纤维化中,成纤维细胞驱动细胞外基质(ECM)重塑和肌动蛋白应力纤维收缩性,从而诱导失调的ECM力学微环境,这反过来又维持了它们的持续激活。ECM拓扑是力学微环境的一个关键特征。ECM拓扑是指ECM纤维取向,它与细胞取向相互作用。在癌症中,ECM和细胞取向从随机(各向同性)转变为对齐(各向异性),而在纤维化中,这些取向转变在不同器官和组织中表现出不同的模式。因此,理解成纤维细胞取向与其在癌症和纤维化中的激活和异质性之间的关系,可能有助于确定新的治疗靶点。建立该方案是为了通过简单且经济有效的方法制备仿生拓扑微图案阵列芯片,以诱导成纤维细胞的各向异性/各向同性。建立了一种通过微接触印刷制备矩形(300 × 50 μm)和正方形(300 × 300 μm)微图案阵列芯片的方法,使用脱细胞ECM作为生物墨水。微图案阵列芯片诱导各向异性/各向同性成纤维细胞,通过F-肌动蛋白染色和快速傅里叶变换分析成纤维细胞取向。这些芯片能够进行原位免疫荧光染色和成像。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
如何通过仿生拓扑微图案阵列诱导成纤维细胞各向异性/各向同性取向,并表征其表型特征?
核心机制
文中未明确说明
主要证据
免疫荧光染色显示,各向同性MRC-5细胞α-SMA表达低于各向异性细胞,而Ki-67阳性细胞数显著多于各向异性细胞。
研究意义
微图案阵列芯片可作为诱导成纤维细胞各向异性/各向同性取向的新型平台,理解其与激活和异质性的关系可能有助于确定纤维化和癌症的新型治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

制备脱细胞ECM支架

获得组织特异性ECM材料作为生物墨水

使用巴马小型猪肺通过灌注脱细胞流程制备dECM,包括冻融、去离子水灌注、去垢剂处理等,冻干后储存。

2

制备dECM水凝胶

将dECM粉末转化为可用于微接触印刷的生物墨水

将dECM粉末用胃蛋白酶消化,中和至pH 7.2-7.4,调整浓度至10 mg/mL。

3

通过微接触印刷制备微图案阵列芯片

在培养皿上形成矩形或正方形dECM微图案

定制PDMS印章,表面镀有立方体突起,涂覆dECM水凝胶,干燥后压印至培养皿。

4

在微图案阵列芯片上培养成纤维细胞

使成纤维细胞附着在微图案上并维持单层培养

用Pluronic F-127处理芯片防止非特异性粘附,紫外线灭菌,接种MRC-5细胞,培养3天。

5

分析成纤维细胞取向

定量评估成纤维细胞在微图案上的取向程度

F-肌动蛋白染色,共聚焦成像,使用ImageJ进行FFT分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化

产品清单

实验环节名称品牌货号
Zoletil 50Virbac--
丙泊酚Qingyuan Jiabo--
Triton X-100Biofroxx--
月桂醇聚醚硫酸酯钠Biofroxx--
葡萄糖Sigma-Aldrich--
胃蛋白酶Sigma-Aldrich--
盐酸----
聚二甲基硅氧烷印章----
异硫氰酸荧光素异构体Sigma-Aldrich--
细胞培养皿BIOFIL--
改良Eagle培养基----
胎牛血清Gibco--
非必需氨基酸Gibco--
GlutaMAXGibco--
青霉素-链霉素溶液HyClone--
Pluronic F-127Sigma-Aldrich--
罗丹明标记的鬼笔环肽Cytoskeleton--
DAPIBiosharp--
抗α-SMA抗体Abcamab7817
抗Ki-67抗体Abcamab16667
二抗Invitrogen--
共聚焦显微镜Nikon--
威利磨RetschMM400

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
制备脱细胞ECM支架
动物体重、麻醉剂量、灌注液种类和顺序、灌注时间、冻融次数
阅读提示:Methods: Preparation of decellularized ECM scaffolds
制备dECM水凝胶
胃蛋白酶浓度、消化时间、中和pH、最终浓度
阅读提示:Methods: Preparation of dECM hydrogel
微接触印刷
PDMS印章尺寸、微图案尺寸、间距、涂覆浓度、压印力、压印时间
阅读提示:Methods: Fabrication of micropattern array chips by microcontact printing; 图2
细胞培养
细胞系、接种密度、培养时间、Pluronic F-127浓度
阅读提示:Methods: Culture of fibroblasts on micropattern array chips; 图3
取向分析
染色浓度、孵育时间、成像方法、FFT分析参数
阅读提示:Methods: Analysis of fibroblast orientations; Fast Fourier transform analysis; 图3