差异表达分析和WGCNA网络构建
鉴定与尼古丁代谢相关的差异表达基因（DE-NRGs）
在TCGA-COAD队列中，使用DESeq2进行差异表达分析，鉴定出5,334个DEGs；通过ssGSEA计算NRG评分，并使用WGCNA构建共表达网络，最终确定767个DE-NRGs。
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一个九基因尼古丁代谢特征预测结肠腺癌的预后并表征免疫景观
A nine-gene nicotine-metabolism signature predicts prognosis and characterizes the immune landscape in colon adenocarcinoma.
实验完整度
中研究主要基于公共数据库的生物信息学分析，仅通过qRT-PCR在细胞系中验证基因表达，缺乏体内或功能机制实验。
主要模型
Caco-2人结直肠癌细胞系 NCM460人结肠粘膜上皮细胞系 TCGA-COAD队列 GSE17536和GSE39582队列 GSE132257单细胞数据集
重点核对
TCGA-COAD队列包含471个COAD样本和41个正常组织，其中438例有生存数据 GSE17536（n=177）和GSE39582（n=562）作为外部验证队列 单细胞数据集GSE132257包含10个结直肠癌样本 qRT-PCR使用Caco-2和NCM460细胞系，培养条件为DMEM含10%FBS、1%青霉素和链霉素，5% CO2，37℃ 风险评分公式为RiskScore = FOXC1×0.195 + TRIP6×0.207 + NRCAM×0.248 + TIMP1×0.426 + TSPAN11×(-1.076) + STC2×0.187 + CST2×0.178 + SIX2×0.258 + GPRASP1×0.517
摘要
吸烟是结直肠癌（CRC）的可预防病因，而尼古丁代谢可能促进肿瘤发生。我们旨在研究尼古丁代谢相关基因（NRGs）在结肠腺癌（COAD）中的预后意义，并开发用于患者分层的基因特征。使用癌症基因组图谱COAD队列，我们进行了差异表达分析和加权基因共表达网络分析以鉴定NRGs。应用功能富集、Cox回归和最小绝对收缩和选择算子（LASSO）建模构建多基因特征，并在外部队列中验证。使用单细胞转录组数据和免疫浸润分析评估基因表达模式和肿瘤微环境特征。我们鉴定了767个差异表达的NRGs，富集于细胞外基质（ECM）组织和信号通路。推导了一个九基因特征（FOXC1， TRIP6， NRCAM， TIMP1， TSPAN11， STC2， CST2， SIX2， GPRASP1）；该风险模型独立预测总生存期，并在多个数据集中表现稳健。单细胞分析证实了这些基因的细胞类型特异性表达。高风险评分与免疫细胞浸润改变、独特的突变谱和不同的药物敏感性模式相关。我们提出了一种新的基于NRG的预后特征，可准确预测COAD的结局。该模型强调了尼古丁代谢、ECM重塑和免疫反应之间的相互作用，突出了可能为未来治疗分层提供信息的基因和通路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 尼古丁代谢相关基因（NRGs）在结肠腺癌（COAD）中的预后意义及其与肿瘤微环境的关系如何？
- 核心机制
- 该九基因特征与细胞外基质（ECM）重塑、TGF-β信号通路、免疫抑制性微环境以及KRAS/PIK3CA突变相关，表明尼古丁代谢可能通过影响ECM和免疫应答促进肿瘤进展。
- 主要证据
- 基于TCGA-COAD、GSE17536和GSE39582队列的生存分析、ROC曲线验证了模型的预后价值；单细胞RNA测序显示基因在不同细胞类型中的表达；免疫浸润分析发现高风险组免疫抑制细胞（MDSC、巨噬细胞、Treg）增加；qRT-PCR验证了基因表达差异。
- 研究意义
- 该九基因特征可作为COAD患者个体化风险分层和预后评估的工具，并可能为靶向尼古丁代谢相关通路（如TIMP1、TRIP6、SIX2）的治疗策略提供依据，但需前瞻性实验验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
功能富集分析
探索DE-NRGs涉及的生物学过程和信号通路
使用clusterProfiler进行GO和KEGG富集分析，发现DE-NRGs富集于ECM组织、细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt信号通路等。
风险模型构建
筛选与生存相关的基因并构建预后模型
对767个DE-NRGs进行单变量Cox回归（P<0.10），然后进行LASSO（10折交叉验证，λ=0.02705889）和双向逐步多变量Cox回归，最终得到9个基因的风险模型。
模型评估与外部验证
评估模型的预测性能并验证其稳健性
在TCGA-COAD、GSE17536和GSE39582队列中绘制K-M生存曲线和ROC曲线，计算AUC值，并与其他七个已发表特征比较HR。
单细胞RNA测序分析
分析预后基因在单细胞水平的表达模式
使用GSE132257数据集，通过Seurat包进行聚类和细胞类型注释，分析9个预后基因在不同免疫细胞和基质细胞中的表达。
免疫微环境分析
评估高风险和低风险组之间免疫细胞浸润、免疫检查点表达及免疫治疗响应差异
使用ssGSEA评估23种免疫细胞浸润水平，比较免疫检查点和免疫功能评分，计算TIDE和IPS评分。
突变分析
比较高风险组和低风险组的基因突变谱
使用maftools分析TCGA-COAD样本的突变情况，发现高风险组KRAS（50%）和PIK3CA（39%）突变频率较高，低风险组BRAF（16%）更常见。
亚型聚类分析
基于预后基因表达对COAD肿瘤样本进行分子分型
使用ConsensusClusterPlus进行共识聚类，确定两个亚型Cluster A和Cluster B，并比较其生存差异和通路富集。
药物敏感性分析
评估不同风险组对常用抗肿瘤药物的敏感性差异
使用oncoPredict评估198种药物的IC50，比较高低风险组间的差异，发现高风险组对IGF1R和AZD1332更敏感，低风险组对AZD5991和ABT737更敏感。
表达验证
验证预后基因在肿瘤和正常组织中的表达差异
在TCGA-COAD中分析基因表达，并使用qRT-PCR在Caco-2和NCM460细胞系中验证表达模式。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Procell | PM150210 |
| 胎牛血清 | Procell | 164210 | |
| 青霉素和链霉素 | Procell | PB180120 | |
| RNA提取 | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒V2 | Vazyme | RC112-01 |
| 反转录 | HiScript III 逆转录预混液（qPCR用，去基因组DNA） | Vazyme | R323-01 |
| qRT-PCR | ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-02 |
| LightCycler 480 II 实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据来源 | TCGA-COAD队列包含471个肿瘤样本和41个正常组织，其中438例有生存数据；外部验证队列GSE17536（n=177）和GSE39582（n=562）；单细胞数据集GSE132257（10个样本） 阅读提示：Methods - Data sources |
| 差异表达分析 | 差异表达筛选标准：|log2FC|>1，调整后P<0.05；WGCNA参数：软阈值β=4，最小模块大小100，合并阈值0.2 阅读提示：Methods - Differential analysis and construction of the weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) network |
| 风险模型构建 | LASSO参数：10折交叉验证，最优λ=0.02705889；双向逐步多变量Cox回归基于AIC最小化；风险评分公式及系数 阅读提示：Methods - Construction and assessment of a risk model; Results - Construction of a risk model based on nine prognostic characteristics |
| 细胞培养和qRT-PCR验证 | 细胞系：Caco-2（人CRC细胞）和NCM460（人结肠粘膜上皮细胞）；培养条件：DMEM（Procell, PM150210）含10%FBS（Procell, 164210）、1%青霉素和链霉素（Procell, PB180120），5% CO2, 37℃；qRT-PCR试剂盒：FastPure RNA提取试剂盒（Vazyme, RC112-01）、HiScript III RT SuperMix（Vazyme, R323-01）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme, Q711-02）；内参GAPDH；2^-ΔΔCt方法 阅读提示：Methods - Expression analysis of prognostic characteristics |