家系临床评估与样本采集
明确家系成员的临床表现和FAP诊断，收集用于基因检测的血液样本。
招募一个中国FAP家系，收集4名家庭成员的血样，并进行临床评估，包括结肠镜、病理检查和影像学。
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在一个中国家族性腺瘤性息肉病家系中鉴定出一个新的致病性APC基因变异
A novel pathogenic APC variant identified in a Chinese pedigree with familial adenomatous polyposis.
实验完整度
中包含家系临床评估、WES与Sanger验证，以及SW480细胞中APC变异的功能验证（Western blot检测β-catenin），但缺乏动物模型或类器官等多层级验证。
主要模型
SW480细胞系（内源性缺乏功能性APC） 中国FAP家系（三代，含4名成员）
重点核对
APC c.3799dup变异在家族成员中的存在与表型共分离 WES筛选、Sanger测序验证 SW480细胞分为空载体、APC-WT、APC-Mutant三组 Western blot检测β-catenin蛋白水平 统计方法：单因素方差分析、Tukey多重比较，重复3次
摘要
背景：家族性腺瘤性息肉病是一种常染色体显性遗传病，其特征是结直肠多发息肉和对结直肠癌的高度易感性，主要由APC基因的胚系变异引起。本研究旨在鉴定并功能验证一个中国FAP家系中的新APC变异。方法：招募了一个三代中国FAP家系。采集家庭成员外周血样提取基因组DNA。进行全外显子组测序筛选候选变异，并使用Sanger测序进行验证。将SW480细胞分为三组：空载体组、APC野生型组和APC突变组。通过Western blot检测β-catenin蛋白表达水平，以评估所鉴定变异的功能影响。结果：先证者的FAP相关结直肠癌被鉴定为高度微卫星不稳定，并伴有经典的MLH1/PMS2双缺失模式。在所有患病家庭成员中鉴定出一个新的胚系变异APC c.3799dup，而未患病个体中不存在该变异。Western blot分析显示，APC-WT组的β-catenin蛋白水平显著低于APC-Mutant组（P < 0.05）和空载体组（P < 0.01）。这表明c.3799 dup变异消除了APC促进β-catenin降解的能力，导致Wnt/β-catenin通路持续激活。结论：新的APC变异c.3799 dup是与FAP相关的致病性变异。我们的发现扩大了已知APC变异的谱系，并为该变异的致病性提供了功能证据。先证者中FAP与MSI-H的罕见共存丰富了FAP相关肿瘤的分子表型谱。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在一个中国FAP家系中鉴定出的新APC变异c.3799dup是否具有致病性及其功能影响。
- 核心机制
- c.3799dup移码变异导致APC蛋白截短，丧失促进β-catenin降解的功能，导致Wnt/β-catenin通路持续激活，这与FAP的发病机制一致。
- 主要证据
- WES和Sanger测序证实c.3799dup变异与FAP表型共分离；Western blot显示APC-Mutant组β-catenin蛋白水平显著高于APC-WT组，与空载体组无显著差异，表明突变体丧失降解β-catenin的功能。
- 研究意义
- 该发现扩大了已知APC变异的谱系，为变异致病性提供了功能证据；FAP与MSI-H的罕见共存丰富了FAP相关肿瘤的分子表型谱，提示APC突变引起的基因组不稳定性可能与MMR基因异常协同促进肿瘤进展，并对FAP相关结直肠癌的个体化治疗具有临床意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全外显子组测序与Sanger验证
筛选并验证APC基因的候选致病性变异。
对先证者III-2进行WES，对可用家系成员进行Sanger测序验证候选变异。
质粒构建与细胞分组
构建APC突变体表达载体，准备用于功能验证的细胞模型。
购买pCMV-APC-3Flag-Neo和空载体，构建APC-Mutant（c.3799_3800insA）载体，转化至DH5α并验证，再将SW480细胞分为三组进行转染。
Western blot检测β-catenin表达
评估野生型和突变型APC对β-catenin蛋白水平的影响，验证功能。
提取转染细胞总蛋白，通过Western blot检测β-catenin表达，以β-actin作为内参。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因检测 | 血液基因组DNA小提试剂盒 | Beiwo | -- |
| 测序 | NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- |
| 质粒构建 | pCMV-APC-3Flag-Neo载体 | Chuling | -- |
| pCMV-3Flag空载体 | Chuling | -- | |
| 定点突变试剂盒 | Vazyme | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| β-catenin抗体 | CST | #8480 | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| HRP偶联二抗 | Servicebio | GB23301和GB23303 | |
| ECL化学发光底物 | -- | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9.0 | GraphPad Software | -- |
| Sanger测序 | Primer3软件 | -- | -- |
| Superyears经典遗传分析仪 | Superyears | -- | |
| Sangon Biotech合成的引物 | Sangon Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 家系临床评估与样本采集 | FAP诊断标准、家系成员表型、血样采集与存储方式 阅读提示：详见Materials and methods中的'Patients and sample collection'部分，以及Table 2 |
| WES和Sanger测序 | 测序平台、参考基因组版本、变异筛选参数、引物序列 阅读提示：详见'Genetic testing methods'部分及Table 1 |
| 质粒构建与转染 | 载体、突变构建位点、转染试剂、细胞密度（未报告） 阅读提示：详见'Plasmid construction'和'Cell culture and transfection'部分 |
| Western blot | 抗体稀释比例、蛋白上样量、内参选择、曝光时间 阅读提示：详见'Western blot analysis'部分及Figure 3图注 |
| 统计分析 | 统计方法、重复次数、p值阈值 阅读提示：详见'Statistical analysis'部分 |