网络药理学预测18β-GA靶点与肾癌靶点
预测18β-GA治疗肾癌的潜在靶点
通过Swisstargetprediction和PharmMapper预测18β-GA靶点，GeneCards获取肾癌靶点，GEO数据集GSE46699差异表达基因，取交集得到35个靶点。
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18β-甘草次酸通过miR-27a-5p/LC3轴诱导自噬抑制肾癌细胞增殖的机制研究
Study on the mechanism of 18β-glycyrrhetinic acid inhibiting the proliferation of renal cancer cells by inducing autophagy through the miR-27a-5p/LC3 axis.
实验完整度
中包含网络药理学、转录组测序、细胞活力、凋亡、周期、集落形成及Western blot等体外验证，但缺乏动物体内实验。
主要模型
786-O人肾癌细胞系 ACHN人肾癌细胞系 HK-2人肾皮质近曲小管上皮细胞
重点核对
18β-GA处理浓度：低、中、高分别为40、55、70 μM，处理24小时 miR-27a-5p敲低和过表达慢病毒转染效率验证 LC3蛋白表达：Western blot检测LC3II/LC3I比值 细胞活力检测：CCK-8法，细胞接种密度8000细胞/孔（786-O和ACHN）
摘要
背景：肾癌是一种常见的侵袭性泌尿系统恶性肿瘤，具有严重的治疗毒性和不良预后等临床挑战；18β-甘草次酸（18β-GA）是中草药甘草的活性成分，具有强效抗肿瘤活性，但其在肾癌中的作用和分子机制尚不清楚。目的：本研究探讨18β-GA抑制肾癌细胞增殖的机制。方法：结合全转录组测序和网络药理学，我们确定了18β-GA调节的关键分子miR-27a-5p及其核心肾癌靶点；细胞实验证实了18β-GA介导的肾癌细胞增殖抑制。慢病毒介导的miR-27a-5p调节验证了其在肾癌增殖中的作用，Western blot检测自噬标志物LC3的表达阐明了miR-27a-5p/LC3轴参与18β-GA的抗肾癌作用。结果：研究表明18β-GA可能通过靶向HMOX1、HCK、CASP1和IDO1发挥抗肾癌作用，其机制通过功能富集分析与自噬通路相关；全转录组测序确定miR-27a-5p是18β-GA在肾癌细胞中变化最显著的miRNA。实验验证证实，18β-GA下调miR-27a-5p以提高自噬标志物LC3II/LC3I比值，激活自噬，降低786-O和ACHN细胞活力，促进凋亡，抑制集落形成，从而抑制肾癌细胞增殖。结论：18β-GA通过下调miR-27a-5p并解除其对LC3介导的自噬通路的抑制，诱导自噬并抑制肾癌细胞增殖，提示miR-27a-5p/LC3轴可能是18β-GA治疗肾癌的关键靶点。关键词：18β-甘草次酸，自噬，miR-27a-5p/LC3轴，增殖，肾癌
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 18β-GA是否通过miR-27a-5p/LC3轴调节自噬来抑制肾癌细胞增殖？
- 核心机制
- 18β-GA下调miR-27a-5p，解除其对LC3介导的自噬通路的抑制，从而激活自噬，抑制肾癌细胞增殖。
- 主要证据
- 通过CCK-8、流式细胞术、集落形成实验和Western blot，在786-O和ACHN细胞中证实18β-GA降低细胞活力、诱导凋亡、阻滞G0/G1期、抑制集落形成，且miR-27a-5p敲低上调LC3II，过表达下调LC3II。
- 研究意义
- 提示miR-27a-5p/LC3轴可能是18β-GA治疗肾癌的关键靶点，为肾癌治疗提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
WGCNA分析和核心靶点筛选
筛选与肾癌相关的关键基因模块
对GSE46699进行WGCNA分析，取模块基因与交集基因再次交集，得到20个靶点。
富集分析和机器学习算法筛选核心靶点
进一步筛选核心靶点并分析相关通路
通过PPI网络筛选7个关键靶点，经Lasso、SVM和随机森林算法取交集得到6个核心靶点。
临床试验分析
分析核心靶点的临床意义
通过GEPIA2.0、UALCAN等数据库分析核心靶点的mRNA表达、拷贝数、蛋白表达、临床分期等。
全转录组测序鉴定差异miRNA
鉴定18β-GA处理肾癌细胞后差异表达的miRNA
对18β-GA处理和未处理的肾癌细胞进行全转录组测序，每组三个生物学重复，筛选出最显著差异的miR-27a-5p。
验证18β-GA对肾癌细胞增殖的抑制作用
验证18β-GA抑制肾癌细胞增殖
通过CCK-8检测细胞活力、流式细胞术检测凋亡和细胞周期、集落形成实验检测克隆形成能力。
验证miR-27a-5p对肾癌细胞增殖和自噬的调控
验证miR-27a-5p对肾癌细胞增殖和自噬的影响
通过慢病毒敲低或过表达miR-27a-5p，检测集落形成、凋亡、细胞周期和LC3蛋白表达。
验证18β-GA通过miR-27a-5p/LC3轴发挥作用
验证18β-GA通过miR-27a-5p调节LC3表达
在miR-27a-5p过表达的基础上加18β-GA处理，检测克隆形成、凋亡、细胞周期和LC3蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco USA | 8122261 |
| MEM/EBSS培养基 | Hyclone USA | SH30024.01 | |
| 胎牛血清 | Gemini USA | 900-108 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco USA | P1400 | |
| 药物处理 | 18β-甘草次酸 | Sigma USA | G10105-10G |
| 5-氟尿嘧啶 | -- | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Thermo Fisher Scientific USA | 343706 |
| qRT-PCR | TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa Japan | RR820A |
| PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa Japan | RR047A | |
| 蛋白提取 | 总蛋白提取试剂盒 | Jiangsu KeyGEN BioTECH Co.Ltd. | KGP2100 |
| 蛋白定量 | BCA定量试剂盒 | Jiangsu Beyotime Biotechnology Co.Ltd. | P0012 |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Beijing Biotopped Technology Co.Ltd. | C6470-5g |
| 凋亡检测 | 细胞凋亡试剂盒 | Jiangsu KeyGEN BioTECH Co.Ltd. | KGA1023 |
| 细胞周期检测 | 细胞周期试剂盒 | Jiangsu KeyGEN BioTECH Co.Ltd. | KGA511 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore USA | ISEQ00010 |
| 无蛋白快速封闭液 | Enzyme Biotechnology Co.Ltd. | PS108P | |
| GAPDH抗体 | Wuhan Sanying Biotechnology Co.Ltd. | 60004-1-Ig | |
| LC3兔多克隆抗体 | Wuhan Sanying Biotechnology Co.Ltd. | 14600-1-AP | |
| ECL化学发光液 | Affinity USA | KF8003 | |
| 山羊抗小鼠 | Affinity USA | S0002 | |
| 山羊抗兔 | Affinity USA | S0001 | |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Kangwei Century Biotechnology Co.Ltd. | CW0027 | |
| 电泳缓冲液(10x) | Enzyme Biotechnology Co.Ltd. | PS105S | |
| PAGE凝胶制备试剂(10%) | Enzyme Biotechnology Co.Ltd. | PG212 | |
| TBST缓冲液 | Wuhan Selleck Biotechnology Co.Ltd. | G0001 | |
| 慢病毒转染 | HiTransG A | -- | -- |
| HiTransG P | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 786-O细胞使用RPMI-1640培养基，ACHN细胞使用MEM培养基，添加10%FBS和1%青霉素-链霉素，37°C、5%CO2培养。 阅读提示：见Materials and methods 2.15 |
| 药物处理 | 18β-GA浓度：低、中、高分别为40、55、70 μM，处理24小时；5-Fu IC50分别为35 μg/mL和30 μg/mL。 阅读提示：见Results 3.15.1及图10 |
| 细胞活力检测 | CCK-8法，786-O和ACHN细胞接种密度8000细胞/孔，HK-2为6000细胞/孔，处理24、48、72小时。 阅读提示：见Materials and methods 2.16 |
| 凋亡检测 | 流式细胞术，使用Binding Buffer和染色液，避光孵育15分钟，1小时内检测。 阅读提示：见Materials and methods 2.20 |
| 细胞周期检测 | 流式细胞术，细胞固定于70%预冷乙醇，4°C过夜，染色液Rnase A:PI=1:9，室温避光30分钟。 阅读提示：见Materials and methods 2.19 |
| 集落形成实验 | 细胞接种密度500细胞/孔，培养10天，2%结晶紫染色，计数直径>1mm的克隆。 阅读提示：见Materials and methods 2.18 |
| 慢病毒转染 | 细胞密度4×10^4 cells/mL，MOI和病毒滴度计算病毒体积，ACHN加HiTransG A，786-O加HiTransG P，转染后10小时换液，效率>90%后实验。 阅读提示：见Materials and methods 2.17 |
| Western blot | BCA定量，SDS-PAGE分离，PVDF膜转膜，快速封闭液封闭15分钟，一抗4°C过夜，二抗室温2小时，ECL曝光。 阅读提示：见Materials and methods 2.22 |
| qRT-PCR | Trizol提取RNA，OD260/OD280比值1.8-2.1，使用PrimeScript RT试剂盒反转录，2^-ΔΔCT法分析。 阅读提示：见Materials and methods 2.21 |