患者队列建立与临床数据收集
收集新诊断HCC患者的临床信息和生存数据，评估ctDNA突变与预后的关系。
前瞻性纳入2022年3月至2023年10月在北京佑安医院新诊断的HCC患者，采集血浆进行ctDNA检测，并记录临床信息、治疗和随访数据。
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肝细胞癌患者血浆循环肿瘤DNA变异与生存期的相关性分析
Correlation analysis between plasma circulating tumour deoxyribonucleic acid variations and survival in patients with hepatocellular carcinoma.
实验完整度
中包含临床队列ctDNA测序及生存分析，并有细胞实验（CRISPR敲除、MTT）验证LRP1B功能，但缺乏动物模型或独立验证。
主要模型
HepG2细胞系
重点核对
患者样本量和纳入时间（166例，2022年3月至2023年10月） ctDNA检测方法和阈值（825基因panel，测序深度10000×，检测下限0.1%） TMB截断值（10 muts/Mb） LRP1B敲除细胞系构建（sgRNA序列和转染条件） MTT增殖实验条件（细胞密度、处理时间、lenvatinib浓度）
摘要
目的：本研究旨在分析肝细胞癌（HCC）患者循环肿瘤DNA（ctDNA）的变异。方法：前瞻性纳入2022年3月至2023年10月期间新诊断的HCC患者。治疗前进行血浆ctDNA检测，并收集临床信息、治疗方案和生存数据。结果：共纳入166例HCC患者，其中男性127例，女性39例，平均年龄58.1±10.0岁。其中，137例感染乙型肝炎病毒，129例合并肝硬化。根据巴塞罗那临床肝癌（BCLC）分期系统，分别有74、20、52和20例患者为A、B、C、D期。肿瘤突变负荷（TMB）范围为0至35.48个突变/Mb；其随BCLC分期升高而增加，但在D期下降。突变频率最高的五个基因为TP53（39.8%）、CTNNB1（15.7%）、LRP1B（12.0%）、ARID1A（10.8%）和FAT3（9.0%）。TP53和LRP1B突变患者生存期较短（p < 0.05）。在接受全身治疗的54例患者中，仅LRP1B突变患者的总生存期（OS）显著降低（p = 0.048）。Cox多变量生存分析显示，TMB和Child–Pugh评分与OS密切相关。无论肿瘤分期如何，在接受全身治疗的患者中，LRP1B突变与OS显著相关。结论：循环肿瘤DNA检测显示，TMB与HCC患者的OS密切相关。接受全身治疗的LRP1B突变HCC患者生存期显著缩短。循环肿瘤DNA检测在预测HCC预后方面具有重要价值，并可作为评估患者结局的生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在分析HCC患者血浆ctDNA变异及其与预后和治疗疗效的相关性。
- 核心机制
- 文献提出LRP1B可能通过PI3K/AKT通路影响HCC细胞增殖和耐药，但仅作为讨论中的机制假设，未在本文实验中直接验证。
- 主要证据
- 临床队列（166例）ctDNA测序显示TMB和LRP1B突变与OS相关；细胞实验显示敲除LRP1B增强HepG2细胞增殖并增加lenvatinib耐药。
- 研究意义
- ctDNA检测可能作为预测HCC预后的液体活检方法，并可能作为评估患者结局的生物标志物，但需进一步研究验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ctDNA测序与突变分析
检测血浆ctDNA突变，分析TMB和基因突变频率与临床特征的关系。
使用825基因panel对血浆ctDNA进行高深度测序（10000×），分析TMB和基因突变。
生存分析
评估基因突变和TMB对HCC患者OS的影响。
采用Kaplan-Meier法和Cox回归分析基因突变和TMB与OS的相关性。
LRP1B功能验证
验证LRP1B对HCC细胞增殖和lenvatinib耐药的影响。
使用CRISPR/Cas9在HepG2细胞中敲除LRP1B，并通过Western blot确认，然后进行MTT增殖实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ctDNA检测 | 实体瘤肿瘤精准医学825基因panel试剂盒 | Genetron Health (Beijing) Co., Ltd. | -- |
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | Gibco | 16600-082 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| CRISPR基因敲除 | T4多核苷酸激酶 | NEB | M0201 |
| pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0质粒 | Addgene | 62988 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000-015 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Sigma | P8833 |
| 细胞克隆 | 克隆环 | Sigma | Z37,104-4 |
| Western blot | 被动裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| BCA法蛋白定量 | Thermo | -- | |
| 化学发光底物试剂盒 | Tanon and GE | -- | |
| MTT增殖实验 | 甲基噻唑基四唑 (MTT) | Sigma | -- |
| Biotek Synergy H1酶标仪 | Biotek | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列 | 患者诊断标准、纳入排除标准、BCLC分期、样本量166例、随访时间 阅读提示：Materials and methods 2.1, 2.7 |
| ctDNA检测 | 使用825基因panel、测序深度10000×、检测下限0.1% 阅读提示：Materials and methods 2.2 |
| 生存分析 | OS定义、删失处理、Cox模型协变量（BCLC分期、Child-Pugh评分、TMB、基因突变状态） 阅读提示：Materials and methods 2.8, Results 3.4 |
| 细胞培养与基因敲除 | HepG2细胞来源、培养基和添加剂、sgRNA序列、转染试剂和条件、嘌呤霉素筛选浓度和时间 阅读提示：Materials and methods 2.4 |
| MTT增殖实验 | 细胞密度（1000细胞/孔）、培养时间（1-10天）、MTT浓度（0.5 mg/ml）、lenvatinib浓度（30 μM） 阅读提示：Materials and methods 2.6, Figure 3 |