蛋白质和配体库准备
获取USP7蛋白结构并对化合物库进行预处理，为虚拟筛选做准备。
从PDB下载USP7结构（5N9T），使用Schrödinger Maestro 13.5进行预处理（pH 7.4，OPLS4力场能量最小化）。整合四个化合物库共7322个化合物，使用LigPrep预处理，QikProp评估类药性。
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虚拟筛选和分子动力学模拟驱动的USP7抑制剂BML-284的发现
Virtual Screening and MD Simulation-Driven Discovery of USP7 Inhibitors BML-284.
实验完整度
中包含虚拟筛选、分子动力学模拟和多种体外细胞实验（CCK-8、集落形成、EdU、Transwell、Western blot、流式、DARTS），但缺乏动物模型等体内验证。
主要模型
SK-N-BE(2)细胞 IMR-32细胞 SK-N-AS细胞 SH-SY5Y细胞 SK-N-SH细胞
重点核对
USP7蛋白晶体结构（PDB ID: 5N9T） 药物处理浓度：BML-284和P 22077为1 μmol/L和5 μmol/L（Western blot） CCK-8实验细胞密度5×10^3细胞/孔，药物浓度0-100 μmol/L BML-284处理时间24小时（细胞活力、EdU、Transwell） 集落形成实验处理14天
摘要
神经母细胞瘤是一种致命的儿科肿瘤，高危病例（如MYCN扩增）的5年生存率低于50%。由于缺乏小分子结合口袋，直接靶向N-Myc不可行，因此USP7（一种稳定N-Myc的去泛素化酶）成为关键替代靶点。我们通过药物再利用、计算机辅助药物设计（CADD）和分子模拟鉴定了USP7抑制剂：一个包含7322种化合物的库（来自4个数据库）经过多阶段虚拟筛选（HTVS/SP/XP对接+MM/GBSA）获得24个命中化合物，并通过100ns分子动力学（MD）、拉伸分子动力学（SMD）和伞形采样（US）模拟进一步验证。化合物C24（BML-284）脱颖而出，对USP7具有高亲和力（MM/PBSA：−35.36±5.11 kcal/mol）和稳定性（解离能：33.34 kJ/mol，与阳性对照P 22077相当）。体外实验表明，BML-284抑制MYCN扩增和非扩增的NB细胞（IC50：0.6278–1.410 μmol/L）。它还显著抑制集落形成、细胞增殖（反映为EdU+细胞减少）和迁移，所有这些效应均具有统计学显著性。机制上，BML-284下调USP7、N-Myc和MDM2的表达，并促进凋亡（表现为BCL-2减少和Cleaved PARP-N/PARP增加）。此外，DARTS实验证实其与USP7直接结合，结果具有统计学显著性。总之，BML-284是一种有效的USP7抑制剂，通过调节USP7-N-Myc轴发挥抗NB活性。本研究不仅为高危NB治疗提供了新候选药物，也为USP7抑制剂的开发提供了框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在寻找能够间接靶向N-Myc的USP7抑制剂，以改善高危神经母细胞瘤的治疗效果。
- 核心机制
- BML-284通过与USP7直接结合并抑制其表达，下调N-Myc和MDM2，促进凋亡（减少BCL-2、增加Cleaved PARP），从而发挥抗神经母细胞瘤作用。
- 主要证据
- 分子模拟（MM/PBSA结合自由能、SMD/US解离自由能）显示BML-284与USP7高亲和力结合；体外实验（CCK-8、集落形成、EdU、Transwell）证实其抑制多种NB细胞增殖和迁移；Western blot和DARTS实验验证了USP7、N-Myc、MDM2下调及直接结合。
- 研究意义
- 作者提出BML-284为高危NB治疗提供新候选药物，并为USP7抑制剂开发提供框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多阶段虚拟筛选
从化合物库中初步筛选有潜力结合USP7的小分子。
以P 22077为参考配体，使用Glide HTVS、SP、XP对接结合MM/GBSA计算，逐级筛选得到24个命中化合物。
分子动力学模拟和增强采样模拟
验证命中化合物与USP7结合的稳定性和亲和力。
对24个命中化合物进行100ns MD模拟（5次重复），计算MM/PBSA结合自由能；对8个高亲和力配体进行SMD和US模拟，计算解离自由能。
CCK-8细胞活力筛选
测试命中化合物对NB细胞的杀伤活性，筛选具有抗NB活性的化合物。
使用SK-N-BE(2)细胞及不同亚型NB细胞系，设置不同浓度（0-100μM）处理24小时，测定IC50。
细胞功能实验验证BML-284的抑制作用
验证BML-284对NB细胞增殖、集落形成和迁移的抑制作用。
使用SK-N-BE(2)和IMR-32细胞，1μM BML-284处理，进行集落形成（14天）、EdU增殖（24小时）、Transwell迁移（24小时）实验。
Western blot和免疫荧光检测蛋白表达
检测BML-284对USP7、BCL-2、PARP等蛋白表达的影响，评估凋亡和靶点调控。
处理细胞后提取蛋白，Western blot检测USP7、BCL-2、PARP、Cleaved PARP、N-Myc、MDM2；免疫荧光检测USP7表达。
DARTS实验验证直接结合
直接验证BML-284与USP7的物理相互作用。
细胞裂解液与BML-284或P 22077孵育，加Pronase E蛋白酶，检测USP7降解抗性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
计算机辅助药物设计
验证凋亡
验证靶点结合
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Procell | -- |
| MEM培养基 | Procell | -- | |
| 高糖DMEM培养基 | Procell | -- | |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 青霉素-链霉素-庆大霉素溶液 | sevenbio | -- | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | sevenbio | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Procell | -- | |
| 药物处理 | BML-284 | -- | -- |
| P 22077 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | -- | -- |
| 细胞增殖检测 | BeyoClick EdU-594细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | C0078 |
| Transwell迁移实验 | Transwell小室（8 μm孔径） | BIOFIL | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | TargetMol | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物I | TargetMol | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记IgG二抗 | Beyotime | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Beyotime | -- | |
| USP7抗体 | Abmart | T57219 | |
| MDM2抗体 | Abmart | TA0208 | |
| N-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 51705S | |
| GAPDH抗体 | Abmart | P60037 | |
| BCL-2抗体 | Abmart | T40056 | |
| PARP抗体 | Wanlei Biotechnology | WL01932 | |
| Cleaved PARP-N抗体 | Boster Biological Technology | BM3941 | |
| 免疫荧光 | 488山羊抗兔IgG（H+L） | Proteintech | RGAR002 |
| DAPI | -- | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Sevenbio | -- |
| DARTS实验 | Pronase E | MCE | HY-114158 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基种类、FBS浓度、抗生素浓度、培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Methods 2.4 |
| 细胞活力检测 (CCK-8) | 细胞接种密度（5×10^3细胞/孔），药物浓度范围（0-100 μmol/L），DMSO浓度≤0.1%，处理时间24小时，IC50计算 阅读提示：Methods 2.5, 图4和图5图注 |
| 集落形成实验 | 细胞种植密度（500细胞/孔），BML-284浓度（1 μmol/L），处理时间14天，集落计数标准（≥50细胞） 阅读提示：Methods 2.6, 图6B, E, I, L |
| EdU增殖实验 | EdU浓度（最终浓度需根据说明书），标记时间2小时，固定、通透化、染色条件 阅读提示：Methods 2.7, 图6F, G, M, N |
| Transwell迁移实验 | 细胞密度（2×10^5细胞/mL），处理时间48小时，迁移细胞计数 阅读提示：Methods 2.8, 图6C, D, J, K |
| Western blot | 细胞处理（BML-284 1 μmol/L, 24h），抗体稀释度（1:1000），蛋白上样量，内参GAPDH 阅读提示：Methods 2.9, 图8A, G |
| 免疫荧光 | 细胞处理（1 μmol/L, 24h），固定、通透化、封闭条件，一抗稀释度（1:100），二抗稀释度（1:200），DAPI染色 阅读提示：Methods 2.10, 图7A, H |
| 凋亡检测（流式） | 细胞处理（1 μmol/L, 24h），Annexin V-FITC和PI染色，凋亡率计算 阅读提示：Methods 2.11, 图7B, I |
| DARTS实验 | 细胞裂解液蛋白浓度（10 μg/μL），药物浓度（BML-284 1 μmol/L, P 22077 5 μmol/L），Pronase E浓度（2.5 mg/mL），消化时间（15分钟） 阅读提示：Methods 2.12, 图8E, K |