抗菌活性测定
评估Cloxiquine对粪肠球菌的抑制和杀菌活性
采用微量肉汤稀释法测定MIC和MBC，纸片扩散法测定抑菌圈，杀菌动力学和早期杀菌动力学测定，活/死染色观察。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
氯喹新通过破坏质子动力势和诱导活性氧对粪肠球菌发挥杀菌活性
Cloxiquine exerts bactericidal activity against Enterococcus faecalis through disruption of proton motive force and induction of reactive oxygen species.
实验完整度
高包含体外抗菌活性测定（MIC/MBC、杀菌动力学）、生物膜抑制实验、抗性诱导实验、PAE/PA-SME、机制研究（TEM、SYTOX Green、BCECF-AM、ATP、ROS）及两种体内感染模型（皮下脓肿、腹膜炎-脓毒症）和毒性评估。
主要模型
粪肠球菌ATCC 29212 临床分离株EFA 1-EFA 10 小鼠皮下脓肿模型 小鼠腹膜炎-脓毒症模型
重点核对
Cloxiquine浓度：MIC 2-4 μg/mL，MBC 2-4 μg/mL（对E. faecalis ATCC 29212） 培养基：MH和BHI，影响MIC和MBC 处理时间：杀菌动力学测定0-24h，早期杀菌0-60min 体内剂量：30 mg/kg皮下或腹腔注射 重复实验：至少三次独立实验
摘要
背景：粪肠球菌的抗生素耐药性持续上升并在全球传播，对临床治疗构成严峻挑战，迫切需要新型有效药物。结果：我们的研究结果表明，氯喹新（Cloxiquine），一种8-羟基喹啉衍生物，对粪肠球菌表现出快速的杀菌活性，且耐药发展倾向低。此外，氯喹新还能抑制生物膜形成，并对粪肠球菌表现出良好的抗生素后效应。机制研究表明，氯喹新破坏了跨膜质子梯度（质子动力势的主要组分），从而减少ATP产生并增加活性氧积累。同时，氯喹新在体内表现出有效的抗菌作用，且毒性可接受。结论：我们的结果表明，氯喹新可能是治疗粪肠球菌相关难治性感染的有前景的候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估Cloxiquine对粪肠球菌的抗菌活性、作用机制及体内疗效和安全性。
- 核心机制
- Cloxiquine通过破坏质子动力势的跨膜质子梯度（ΔpH）组分，减少ATP合成并增加活性氧积累，从而导致细菌死亡。
- 主要证据
- BCECF-AM探针显示2×MIC Cloxiquine处理使胞内pH升高；1/2×MIC处理显著降低ATP；4×MIC处理增加ROS；TEM显示膜损伤。
- 研究意义
- Cloxiquine可能是治疗粪肠球菌相关难治性感染的有前景的候选药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
联合用药评估
评估Cloxiquine与常规抗生素的联合效应
棋盘稀释法测定FICI。
生物膜抑制实验
评估Cloxiquine对粪肠球菌生物膜形成和代谢活性的影响
结晶紫染色和XTT还原法测定生物膜生物量和代谢活性，SYTO9/PI染色观察。
耐药性诱导实验
评估Cloxiquine诱导耐药的可能性
连续传代15天，测定MIC变化。
抗生素后效应（PAE和PA-SME）测定
评估Cloxiquine的持续抑制效果
短暂暴露后去除药物，测定细菌恢复生长的时间；PA-SME在去除药物后加入亚MIC浓度。
机制研究
阐明Cloxiquine的抗菌机制
TEM观察超微结构，SYTOX Green检测膜通透性，BCECF-AM检测胞内pH，ATP测定，ROS测定。
体内疗效评估
评估Cloxiquine在小鼠感染模型中的抗菌效果
皮下脓肿模型和腹膜炎-脓毒症模型，测定器官或脓肿中的细菌载量。
毒性评估
评估Cloxiquine的体外和体内毒性
溶血实验，CCK-8细胞毒性，体内单次给药后血液学、生化及组织病理学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
联合用药评估
生物膜抑制测定
耐药性诱导
抗生素后效应测定
体内疗效评估
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | Mueller–Hinton肉汤 | Solarbio | -- |
| 脑心浸液肉汤 | Solarbio | -- | |
| 药物处理 | 氯喹新 | MedChem-Express | -- |
| 万古霉素 | MedChem-Express | -- | |
| 蜂毒肽 | MedChem-Express | -- | |
| 抗菌活性测定 | 羊血琼脂平板 | Antu | -- |
| MH琼脂平板 | Antu | -- | |
| 活/死染色 | SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 碘化丙啶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 联合用药评估 | 酶标仪（iMark） | Bio-Rad | -- |
| 生物膜观察 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 膜通透性测定 | SYTOX Green | Thermo Fisher Scientific | -- |
| HEPES缓冲液 | -- | -- | |
| 胞内pH测定 | BCECF-AM | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ATP定量 | ATP检测试剂盒 | -- | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 过氧化氢 | -- | -- | |
| 细胞毒性 | CCK-8试剂 | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 溶血实验 | Triton X-100 | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养 | 菌株：ATCC 29212和临床分离株EFA 1-10；培养基：MH和BHI；培养条件：37°C，200 rpm 摇菌过夜 阅读提示：Materials and methods: Bacterial strains, culture conditions, and reagents |
| MIC/MBC测定 | 接种量：1×10^6 CFU/mL；浓度范围：Cloxiquine系列稀释；培养基：MH或BHI；定义： MIC为抑制可见生长的最低浓度，MBC为杀死99.9%细菌的最低浓度 阅读提示：Materials and methods: Broth microdilution assay |
| 杀菌动力学 | 接种量：1×10^6 CFU/mL；处理浓度：1/4×MIC至4×MIC；时间点：0, 2, 4, 8, 12, 24h；培养条件：37°C, 200 rpm 阅读提示：Materials and methods: Bactericidal kinetics assay; Figure 1E, F |
| 生物膜抑制实验 | 接种量：1×10^6 CFU/mL；培养基：含2%葡萄糖的BHI；处理浓度：1-16 μg/mL；培养：37°C 24h；CV染色测定A570，XTT测定A490 阅读提示：Materials and methods: Biofilm inhibition determination by CV staining and XTT reduction assay; Figure 2 |
| 耐药性诱导 | 菌株：ATCC 29212和EFA 5；药物：Cloxiquine和利福平；起始浓度：1/2×MIC；连续传代15天；每日测定MIC 阅读提示：Materials and methods: Serial passage assay for resistance induction; Figure 3 |
| PAE/PA-SME | 菌株：ATCC 29212和EFA 5；初始暴露：1-4×MIC（PAE），2×MIC（PA-SME）1小时；去除药物后测定0-24h；PA-SME加入1/4-1/2×MIC 阅读提示：Materials and methods: PAE and PA-SME; Figure 4 |
| 机制研究 | 处理浓度：TEM 5×MIC；SYTOX Green 1/4-4×MIC；BCECF-AM 2×MIC；ATP 1/2×MIC；ROS 1/4-4×MIC；处理时间：1小时（ATP、ROS 30min? 待查） 阅读提示：Materials and methods: TEM, SYTOX Green, BCECF-AM, ATP, ROS; Figure 5 |
| 体内实验 | 小鼠：雌性ICR，7周龄，约25g；感染菌量：3×10^8 CFU/mL；给药：皮下或腹腔注射30 mg/kg；感染后1小时给药；24小时后处死 阅读提示：Materials and methods: Murine subcutaneous abscess model, Murine peritonitis-sepsis model; Figure 6 |
| 毒性评估 | 溶血实验浓度：0-64 μg/mL；细胞毒性：A2780, HaCaT, iBMDM；剂量：30 mg/kg单次腹腔注射；评估血液学、生化、组织病理 阅读提示：Materials and methods: Hemolysis assay, Cytotoxicity determination, In vivo toxicity assessment |