Dihydroartemisinin Alleviates Neuronal Damage and Seizures in Epileptic Mice by Inhibiting Ferroptosis via the SIRT1/FOXO1/SLC7A11/GPX4 Pathway.
包含KA诱导小鼠模型、HT22细胞模型、TLE患者脑组织样本三个层级，并通过Western Blot、IF、TEM、分子对接、CHIP-qPCR等进行了功能和机制验证。
KA诱导的癫痫小鼠模型 HT22细胞模型（谷氨酸诱导） 颞叶癫痫（TLE）患者脑组织样本
DHA给药剂量：20 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续30天 KA诱导剂量：20 mg/kg，腹腔注射 谷氨酸浓度：5 mM处理HT22细胞24小时 EX-527（SIRT1抑制剂）剂量：2 mg/kg（体内），10 μM（体外） Fer-1剂量：3 mg/kg，腹腔注射，每日一次，持续30天
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证DHA对癫痫行为和认知功能的影响，以及与铁死亡抑制剂Fer-1的比较。
雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射KA（20 mg/kg）诱导癫痫持续状态，30分钟后给予DHA（20 mg/kg）或Fer-1（3 mg/kg）处理，每日一次，共30天；对照组注射DMSO。通过视频监测记录自发性癫痫发作的潜伏期和次数，采用Morris水迷宫评估认知功能，Nissl染色观察海马神经元损伤。
评估DHA对KA诱导的癫痫小鼠海马中铁死亡相关指标的影响。
Western Blot检测SLC7A11和GPX4蛋白水平；透射电镜观察海马神经元线粒体形态；检测Fe2+含量；试剂盒检测GSH、MDA、4HNE和SOD水平；DHE染色检测ROS水平。
在体外验证DHA对神经元损伤和铁死亡的影响。
使用5 mM谷氨酸处理HT22细胞24小时模拟癫痫体外模型，同时给予DHA（10 μM）或Fer-1（5 μM）处理。检测细胞活力（CCK-8）、SLC7A11和GPX4蛋白水平、Fe2+含量、GSH、MDA、4HNE和SOD水平以及ROS水平。
确认SIRT1作为DHA作用靶点，参与抑制铁死亡和减轻癫痫发作。
Western Blot和免疫荧光检测SIRT1表达；分子对接预测DHA与SIRT1结合。使用SIRT1抑制剂EX-527（体内2 mg/kg，体外10 μM）阻断SIRT1活性，评估对DHA效应的影响，包括癫痫行为、神经元损伤、铁死亡标志物、SLC7A11和GPX4表达。
阐明SIRT1调控SLC7A11转录的具体分子机制。
qRT-PCR检测SLC7A11 mRNA水平；利用数据库预测SLC7A11转录因子和SIRT1互作蛋白；Western Blot检测FOXO1和乙酰化FOXO1水平，以及FOXO1核转位；CHIP-qPCR验证FOXO1与SLC7A11启动子结合。
为铁死亡与TLE的关联提供临床证据。
收集TLE患者手术脑组织，以TBI患者为对照，Western Blot检测SLC7A11和GPX4蛋白表达，检测Fe2+、GSH、MDA和SOD水平。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 体内实验 | 海人酸 | Sigma | 420318 |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| EX-527 | MCE | HY-15452 | |
| 细胞培养 | HT22细胞 | Procell Life Science & Technology Co. Ltd. | -- |
| DMEM培养基 | Sigma | D6429 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 体外模型 | 谷氨酸 | Sigma | G8415 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 胞浆胞核蛋白提取试剂盒 | Thermofisher | 78835 | |
| 免疫荧光 | DAPI | Solarbio | C0065 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0037 |
| Fe2+含量检测 | 亚铁离子含量检测试剂盒 | Solarbio | BC5415 |
| 4HNE检测 | 4HNE酶联免疫吸附测定试剂盒 | Zhen Ke Biological Technology Co. Ltd. | -- |
| MDA检测 | 脂质过氧化MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131S |
| SOD检测 | 超氧化物歧化酶活性检测试剂盒 | Solarbio | BC5165 |
| ROS检测 | 二氢乙啶 | Beyotime | S0063 |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026CN |
| 逆转录试剂盒 | TransGen Biotech | AT311 | |
| Top Green qPCR SuperMix试剂盒 | TransGen Biotech | AQ601 | |
| CHIP | 超声染色质免疫沉淀试剂盒 | Abclonal | RK20258 |
| DNA纯化试剂盒 | Abclonal | RK30100 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0 | -- | -- |
| 形态观察 | 荧光显微镜 | Nikon | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系（雄性C57BL/6J，8周龄，20-30g）；诱导药物KA剂量（20 mg/kg，腹腔注射）；DHA剂量（20 mg/kg，腹腔注射，每日一次，30天）；Fer-1剂量（3 mg/kg，腹腔注射）；对照组溶剂（DMSO）；给药时间（注射KA前30分钟给予DHA或Fer-1）；KA后2小时给予地西泮（10 mg/kg）终止发作。 阅读提示：Methods 2.2 Animals; 2.3 In Vivo Experiments |
| 细胞模型建立 | HT22细胞系来源；培养基（DMEM含10%胎牛血清）；谷氨酸浓度（5 mM）；DHA浓度（10 μM）；Fer-1浓度（5 μM）；EX-527浓度（10 μM）；处理时间（24小时）；细胞培养条件（37°C，5% CO2）。 阅读提示：Methods 2.5 Cell Culture and Drugs |
| 铁死亡指标检测 | 检测方法：Western Blot检测SLC7A11和GPX4；TEM观察线粒体形态；Fe2+含量测定试剂盒；GSH和GSSG检测试剂盒；MDA检测试剂盒；SOD活性检测试剂盒；4HNE ELISA试剂盒；DHE染色检测ROS（浓度10 μM，孵育30分钟）。 阅读提示：Methods 2.6-2.15; Figure legends 2-3,5-6 |
| 机制验证 | SIRT1抑制剂EX-527剂量（体内2 mg/kg，体外10 μM）；分子对接；CHIP-qPCR（FOXO1抗体，SLC7A11启动子引物序列）；数据库预测。 阅读提示：Methods 2.17-2.18; Results 3.4-3.7; Figure 7 |
| 临床样本验证 | TLE和TBI患者脑组织样本数（每组n=5）；年龄和性别匹配；检测指标（SLC7A11、GPX4蛋白，Fe2+，GSH，MDA，SOD）。 阅读提示：Methods 2.1 Human Tissues; Results 3.8; Table S3, S4 |
