CRISPR-Cas9全基因组筛选鉴定顺铂耐药基因
在肝癌细胞系中无偏倚地鉴定与顺铂敏感性相关的关键基因。
建立稳定表达Cas9的HepG2和Huh7细胞，转染TKOv3 sgRNA文库，分别用DMSO（对照）或顺铂处理21天，通过测序比较sgRNA丰度变化，利用DrugZ算法和KEGG富集分析。
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CRISPR-Cas9筛选揭示ATOX1驱动的肝癌顺铂耐药机制并评估靶向抑制剂疗效
CRISPR-Cas9 screening identifies ATOX1-driven cisplatin resistance mechanisms in liver cancer and evaluates targeted inhibitor efficacy.
实验完整度
高包含CRISPR-Cas9全基因组筛选、体外细胞功能实验（CCK-8、EdU、克隆形成、流式凋亡）、体内异种移植瘤模型、临床样本IHC及生存分析，并进行了分子动力学模拟、虚拟筛选、SPR等药物研发验证，证据层级丰富且功能验证完整。
主要模型
HepG2和Huh7肝癌细胞系 BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型 肝癌患者组织样本（60例癌及癌旁组织）
重点核对
CRISPR-Cas9筛选：使用TKOv3 sgRNA文库，21天顺铂处理组，对照组为DMSO，HepG2和Huh7细胞系 ATOX1敲低：siRNA（si1-ATOX1）和shRNA（序列为5'-GCAGCTGAACCTGACAACT-3'），稳定敲低细胞系经0.5 μg/mL嘌呤霉素筛选14天 动物实验：BALB/c裸鼠，皮下注射5×10^6 HepG2细胞，顺铂剂量5 mg/kg腹腔注射每周两次，化合物8剂量10 mg/kg腹腔注射每日一次 药物协同实验：化合物8与顺铂浓度组合（0, 2.5, 5, 10 μM），处理48小时，Combination Index (CI) 评估协同效应
摘要
肝癌的顺铂治疗常因耐药而受阻。本研究旨在鉴定与肝癌顺铂耐药相关的关键基因，并开发靶向抑制剂。通过全基因组CRISPR-Cas9筛选，ATOX1被确定为顺铂耐药的关键基因。ATOX1在肝癌组织中高表达，并与不良预后相关。在肝癌细胞中敲低ATOX1在体外和体内均增强了顺铂敏感性。分子动力学模拟和虚拟筛选确定化合物8为有效的ATOX1抑制剂，具有高亲和力（Kd = 12.5 μM），并与顺铂在肝癌细胞生长上表现出协同效应。机制上，化合物8抑制ATOX1的活性，导致细胞内铜积累。升高的铜水平随后促进NOTCH1启动子处DNA甲基化增加，导致NOTCH1/HES1信号通路抑制，并增强肝癌细胞对顺铂的敏感性。总之，ATOX1对肝癌顺铂耐药至关重要，并与不良预后相关。以化合物8靶向ATOX1可能是克服顺铂耐药的新治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在鉴定肝癌中与顺铂耐药相关的关键基因，并开发靶向抑制剂以克服耐药。
- 核心机制
- ATOX1抑制（基因敲低或化合物8）导致细胞内铜积累，铜水平升高促进NOTCH1启动子区域DNA甲基化增加，从而抑制NOTCH1/HES1信号通路，增强肝癌细胞对顺铂的敏感性。
- 主要证据
- 通过CRISPR-Cas9筛选、体外细胞实验（CCK-8、EdU、克隆形成、流式凋亡）、体内异种移植瘤模型、临床样本免疫组化及生存分析，以及分子动力学模拟和SPR等验证，证明ATOX1是关键耐药基因，化合物8与顺铂协同抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 本研究发现ATOX1是肝癌顺铂耐药的关键因子，靶向ATOX1的化合物8可能成为克服顺铂耐药的新型治疗策略，为肝癌的精准治疗提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床样本分析ATOX1表达与预后
评估肝癌患者中ATOX1的表达水平及其与临床预后的关联。
对60例肝癌及配对癌旁组织进行免疫组化染色，分析ATOX1表达差异；结合TCGA和ICGC数据，进行生存分析和顺铂耐药评分相关分析。
体外功能实验验证ATOX1对顺铂敏感性的影响
验证ATOX1表达水平对肝癌细胞顺铂敏感性的因果作用。
使用siRNA敲低或过表达载体上调ATOX1，通过CCK-8、EdU染色、克隆形成和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡变化。
体内异种移植瘤模型验证ATOX1敲低增强顺铂疗效
在体内评估ATOX1敲低联合顺铂对肿瘤生长的抑制作用。
构建BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型，使用ATOX1敲低或对照HepG2细胞，给予DMSO或顺铂处理，定期测量肿瘤体积，实验终点收集肿瘤称重，并进行IHC检测Ki67和ATOX1。
分子动力学模拟与虚拟筛选发现ATOX1抑制剂
识别ATOX1的潜在结合口袋并筛选高亲和力小分子抑制剂。
对ATOX1蛋白（PDB ID: 1FEE）进行100 ns分子动力学模拟，分析RMSD和RMSF；利用AutoDock-vina对ChemDiv数据库150万化合物进行虚拟筛选，通过聚类和对接分析选化合物，购买候选化合物进行实验验证。
化合物活性验证与结合亲和力测定
验证候选化合物对ATOX1的抑制活性和结合亲和力。
通过FRET实验检测化合物对ATOX1-铜结合的抑制效果，SPR测定化合物8的Kd值，PTS实验评估蛋白热稳定性变化。
体外联合用药协同效应评估
评估化合物8与顺铂联合使用在体外对肝癌细胞的协同抑制作用。
用不同浓度的化合物8和顺铂单用或联用处理HepG2和Huh7细胞48小时，CCK-8检测活力，计算联合指数（CI）；通过EdU、克隆形成和凋亡检测进一步验证。
体内联合用药抗肿瘤效果及安全性评估
在动物模型中评估化合物8联合顺铂的抗肿瘤效果及安全性。
建立HepG2皮下移植瘤模型，分别给予DMSO、化合物8、顺铂及联合治疗，测量肿瘤体积和成像，实验终点收集肿瘤进行IHC，并HE染色主要器官评估毒性。
转录组测序及通路富集分析
探究化合物8联合顺铂作用后肝癌细胞的转录组变化及涉及的信号通路。
对HepG2细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因（DEG），进行KEGG和GSEA富集分析，重点关注NOTCH信号通路。
分子机制验证（铜依赖性启动子甲基化）
验证ATOX1抑制导致的细胞内铜积累是否通过促进NOTCH1启动子甲基化来抑制其表达。
使用qRT-PCR和Western blot检测NOTCH1和HES1表达；使用qMSP检测NOTCH1启动子甲基化水平；使用铜螯合剂TTM进行挽救实验。
靶向特异性验证（依赖ATOX1/NOTCH1轴）
确认化合物8的作用依赖于ATOX1，通过NOTCH1轴发挥协同效应，排除脱靶效应。
在ATOX1敲低的肝癌细胞中评估化合物8对NOTCH1启动子甲基化、NOTCH1/HES1表达及细胞增殖的影响；在NOTCH1过表达的细胞中检测联合治疗的抑制效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR-Cas9筛选 | TKOv3 sgRNA文库 | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 慢病毒包装 | pLKO.1-puro载体 | Addgene | 8453 |
| pLenti CMV/TO Puro空载体 | Addgene | 17482 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Invitrogen | -- |
| 稳定细胞系筛选 | 嘌呤霉素 | MCE | -- |
| 蛋白纯化 | BL21(DE3)感受态细胞 | -- | -- |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| FRET实验 | SpectraMax M5多功能酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| PTS实验 | SYPRO Orange荧光染料 | -- | -- |
| SPR分析 | Biacore X100系统 | -- | -- |
| CM5芯片 | -- | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Takara | -- | |
| ABI 7500实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ATOX1抗体 | Abcam | ab154179 | |
| NOTCH1抗体 | CST | 3608 | |
| HES1抗体 | CST | 11988 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| ECL化学发光试剂 | Millipore | -- | |
| 细胞增殖实验 | CCK-8试剂 | Dojindo | -- |
| EdU实验 | Cell-Light EdU Apollo 567体外试剂盒 | RiboBio | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 流式凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| BD FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Tianqin Biotechnology | -- |
| IVIS Spectrum小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| D-荧光素 | -- | -- | |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | CST | 9449 |
| PCNA抗体 | CST | 13110 | |
| 转录组测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 647偶联二抗 | Invitrogen | -- |
| 甲基化检测 | EZ DNA甲基化金试剂盒 | Zymo Research | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR-Cas9筛选 | TKOv3文库转导效率、顺铂处理浓度及时间（21天）、sgRNA丰度测序数据分析软件与参数 阅读提示：Methods: CRISPR-Cas9 library screen; Figure 1A schematic |
| 细胞培养与基因操作 | 细胞系来源和培养基（DMEM+10% FBS）、siRNA序列和转染试剂、puromycin筛选浓度和时长（0.5 μg/mL, 14天） 阅读提示：Methods: Cell culture; siRNA and lentiviral transfection |
| 体外药物敏感性实验 | CCK-8细胞接种密度（5×10^3/孔）、药物处理浓度和时间（化合物8和顺铂各0-10 μM，48小时）、EdU试剂盒品牌和使用方法 阅读提示：Methods: Cell proliferation assays; Drug synergy analysis; Figure 5B,C |
| 动物模型 | 小鼠品系（BALB/c nude）、年龄和体重、细胞接种数量（5×10^6）、药物剂量（顺铂5 mg/kg, 化合物8 10 mg/kg）、给药途径和频率、肿瘤体积计算公式和终点标准 阅读提示：Methods: Animal experiments; Figure 5G |
| 分子机制验证 | qMSP引物序列和PMR计算方法、铜螯合剂TTM使用浓度（5 μM）、NOTCH1和HES1表达检测方法（qRT-PCR和Western blot）、抗体批次和稀释度 阅读提示：Methods: Detection of NOTCH1 gene promoter methylation; Western blotting analysis; Figure 6 |