分泌组学鉴定候选介质
鉴定LPS处理的肺上皮细胞分泌的早期促纤维化因子
对LPS处理的人支气管上皮细胞BEAS-2B进行分泌蛋白质组学分析，筛选上调蛋白，并通过免疫印迹验证候选蛋白的分泌。
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分泌型RCN3通过TGFβR1-Smad信号作为急性肺损伤后肺纤维化中的早期上皮-成纤维细胞介质
Secreted RCN3 acts as an early epithelial-fibroblast mediator via TGFβR1-Smad signaling in post-ALI pulmonary fibrosis.
实验完整度
高包含细胞分泌组学、体外成纤维细胞功能验证、机制研究（co-IP、BLI、报告基因）、体内小鼠模型及患者样本等多层级证据。
主要模型
BEAS-2B人支气管上皮细胞 CP-H011人原代肺成纤维细胞 C57BL/6J小鼠LPS诱导的急性肺损伤模型 组织性肺炎（OP）和特发性肺纤维化（IPF）患者队列
重点核对
验证RCN3分泌是否依赖于N140糖基化 验证RCN3通过ER-Golgi途径分泌 验证RCN3与TGFβR1的直接结合及亲和力 验证RCN3中和抗体的体内给药时间窗和剂量 验证BALF中RCN3的动态变化是否早于TGFβ1
摘要
肺纤维化（PF）由失调的上皮-成纤维细胞相互作用驱动，导致急性肺炎后不良结局。然而，受损上皮释放的早期促纤维化旁分泌介质尚未完全明确。通过对脂多糖处理的肺上皮细胞进行分泌组学分析，我们确定Reticulocalbin 3（RCN3）为一种上皮旁分泌介质。在临床支气管肺泡灌洗液（BALF）样本中，RCN3在活动性纤维化组织的机化性肺炎患者中显著高于稳定纤维化状态的特发性肺纤维化患者。在LPS诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠中，BALF中RCN3的水平峰值早于TGFβ1/FGF2/CTGF，表明其在PF中发挥早期作用。机制上，上皮RCN3通过N140-糖基化依赖的ER-高尔基体途径分泌，并结合TGFβR1，激活成纤维细胞中的典型Smad2/3信号；RCN3还以Smad3依赖性方式上调TGFβ1和TGFβR1/2。在体内，气管内给予外源性RCN3（在无LPS的情况下）足以触发纤维化，而LPS-ALI后早期中和RCN3可减轻纤维化重塑。总的来说，这些发现确定分泌型、应激响应的RCN3为一种早期的上皮旁分泌介质，通过TGFβR1-Smad2/3信号发挥作用，并提名其为ALI后肺纤维化的潜在早期窗口治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 急性肺损伤后，受损上皮细胞释放的早期促纤维化旁分泌介质是什么，以及其作用机制如何？
- 核心机制
- 上皮细胞分泌的RCN3通过N140糖基化依赖的ER-Golgi途径释放，结合TGFβR1并激活Smad2/3信号通路，促进成纤维细胞活化和纤维化。
- 主要证据
- 分泌组学、免疫共沉淀、BLI、细胞实验及体内小鼠模型显示RCN3通过TGFβR1-Smad2/3通路促进纤维化，且早期中和可减轻纤维化。
- 研究意义
- 研究表明RCN3是ALI后肺纤维化的早期治疗靶点，为早期干预提供潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证RCN3分泌途径与糖基化依赖性
确定RCN3是否通过ER-Golgi途径分泌以及N140糖基化的作用
通过免疫印迹、免疫荧光、糖基化突变体和PNGase F处理，分析RCN3分泌及其对N140糖基化的依赖性。
检测体内RCN3分泌动力学
评估ALI后BALF中RCN3的分泌时间曲线
LPS气管内给药诱导小鼠ALI，在不同时间点收集BALF并检测RCN3、TGFβ1、FGF2、CTGF水平。
评估RCN3对成纤维细胞激活的影响
探究分泌型RCN3对肺成纤维细胞活化的作用
用人重组RCN3处理人原代肺成纤维细胞，检测纤维化基因表达和增殖；用RCN3条件培养基或中和抗体处理成纤维细胞，验证其旁分泌作用。
阐明RCN3的机制通路
确定RCN3激活成纤维细胞所依赖的信号通路
进行RNA-seq分析RCN3处理的成纤维细胞转录组变化；检测Smad3磷酸化、报告基因活性及核转位；通过co-IP、抑制剂和siRNA以及BLI验证RCN3与TGFβR1的相互作用。
体内RCN3功能验证
评估RCN3在体内是否足以引起纤维化以及早期中和能否减轻纤维化
气管内给予重组小鼠RCN3（rmRCN3）诱导小鼠纤维化；在LPS-ALI后早期（第2天和第4天）气管内给予抗RCN3抗体中和RCN3，评估纤维化程度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 成纤维细胞培养基 (CM-H011) | Procell | -- | |
| LPS处理 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L6529 |
| 细胞处理 | 重组人RCN3 | Abcam | ab276552 |
| 重组小鼠RCN3 | Abcam | ab277008 | |
| 转化生长因子-β | Sigma | GF346 | |
| 信号通路抑制 | SIS3 | MCE | HY-13013 |
| LY364947 | Abcam | ab141890 | |
| LY2109761 | MCE | HY-12075 | |
| 抗体中和 | 抗RCN3抗体 | Abcepta | AP5788c |
| siRNA敲低 | TGFβR2 siRNA | Santa Cruz | sc-36657 |
| 对照siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| 蛋白脱盐 | MiQumn G25离心脱盐柱 | Chromsep | 110607 |
| 免疫沉淀 | 抗His抗体 | CST | 12698 |
| 免疫印迹 | 抗TGFβR1抗体 | Abcam | ab235578 |
| 抗TGFβR2抗体 | Abcam | ab259360 | |
| 抗磷酸化Smad3 (S423+S425)抗体 | Abcam | ab52903 | |
| 抗Smad3抗体 | Abcam | ab208182 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | CST | 9715 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| cDNA合成 | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | R037A |
| qPCR | TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820 |
| ELISA | 小鼠RCN3 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp. | SEH243Mu |
| 小鼠TGF-β1 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp. | SEA124Mu | |
| 小鼠FGF2 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp. | CEA551Mu | |
| 小鼠CTGF ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp. | SEA010Mu | |
| 人RCN3 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp. | SEH243Hu | |
| 细胞增殖检测 | CCK8检测试剂盒 | LabLead | CK001 |
| 报告基因检测 | SBE报告基因载体 | BPS Bioscience | 60654 |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | RG027 | |
| 蛋白生物素化 | 生物素化试剂盒 | Thermo Scientific | 21329 |
| 蛋白脱盐 | Zeba离心脱盐柱 | Thermo Scientific | 89889 |
| BLI分析 | 链霉亲和素生物传感器 | ForteBio | 18-5001 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | -- | -- |
| 蛋白提取 | 细胞膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime | P0033 |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Beyotime | C1002 |
| 抗RCN3抗体（用于免疫荧光） | Sigma | HPA050402 | |
| 抗高尔基体蛋白97抗体 | Invitrogen | A-21270 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗Flag抗体 | CST | 14793 | |
| 抗Calnexin抗体 | CST | 2679 | |
| 组织学染色 | 苏木素溶液 | BASO | BA-4097 |
| 伊红溶液 | BASO | BA-4098 | |
| Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | G1340 | |
| 免疫组化 | 抗αSMA抗体 | Abcam | ab124964 |
| 抗TGFβ1抗体 | Abcam | ab215715 | |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | -- | -- |
| 蛋白电泳 | SDS-PAGE凝胶 | -- | -- |
| 蛋白染色 | 考马斯亮蓝 | -- | -- |
| 质谱分析 | timsTOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonics | -- |
| 液相色谱 | EASY-nLC 1200系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质谱分析 | C18色谱柱 | -- | -- |
| SOLA固相萃取柱 | -- | -- | |
| 酶解 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| RNA提取 | Mir Vana miRNA提取试剂盒 | Ambion | -- |
| RNA测序 | TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| BLI分析 | Octet RED系统 | ForteBio | -- |
| 显微成像 | Zeiss LSM980共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 组织切片扫描 | Pannoramic 250 FLASH扫描仪 | 3DHISTECH | -- |
| 凝胶成像 | 化学发光成像系统 | SINSAGE | -- |
| 自动化数字凝胶图像分析系统 | Tanon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源（BEAS-2B, CP-H011）及培养基、LPS处理浓度（0.1 μg/mL）和时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods, Cell culture; Figure 1A-C |
| 体内模型 | C57BL/6J小鼠，LPS剂量（5 mg/kg）及给药方式（气管内），时间点（第2,4,7,14天） 阅读提示：Materials and methods, Mouse models; Figure 3 |
| RCN3分泌检测 | BALF中RCN3 ELISA检测方法及时间点 阅读提示：Materials and methods, ELISA; Figure 3D |
| RCN3功能验证 | rhRCN3浓度（0.1 μg/mL）和处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods, Cell culture and Figure 4 |
| 机制验证 | TGFβR1抑制剂浓度（LY364947, LY2109761）、siRNA转染条件、BLI实验条件（RCN3和TGFβR1浓度梯度） 阅读提示：Materials and methods, Reagents and drugs, Immunoprecipitation, Biolayer interferometry; Figure 5 |
| 体内中和实验 | RCN3抗体剂量（2 μg/只）、给药时间（LPS后第2和4天）、评估时间点（第7天） 阅读提示：Materials and methods, Mouse models; Figure 6E-H |