队列宏基因组测序与微生物组成分析
鉴定ESCC肿瘤与配对正常组织间的微生物组成差异
对119例ESCC患者的配对肿瘤和相邻正常组织进行宏基因组测序，经过宿主DNA去除和去污染流程，分析微生物组成。
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瘤内微小小单胞菌通过对甲酚诱导的Treg分化促进食管鳞状细胞癌
Intratumoral Parvimonas micra promotes esophageal squamous cell carcinoma via p-cresol-induced Treg differentiation.
实验完整度
高包含宏基因组、单细胞测序、体外细胞实验、皮下瘤小鼠模型、代谢组学等多层级证据，并进行功能和机制验证。
主要模型
mEC25小鼠皮下移植瘤模型 Jurkat细胞 小鼠脾脏CD4+ T细胞 ESCC患者组织样本
重点核对
P. micra瘤内注射剂量：108 CFU/50 μl，每3天一次，共4次 p-cresol瘤内注射浓度：80 μM，每3天一次，共4次 NAC瘤内注射浓度：4 mM，每3天一次，共4次 mEC25细胞植入量：5×10^6细胞/100 μl PBS 使用6周龄C57BL/6雌性小鼠
摘要
瘤内微生物群已成为影响癌症发生和进展的一个显著因素。然而，其在食管鳞状细胞癌（ESCC）中的组成和功能影响在很大程度上仍未得到充分探索。在此，我们对来自ESCC患者的119对肿瘤-正常组织进行了宏基因组测序，并对45个样本进行了单细胞RNA测序，以研究微生物-宿主相互作用。我们鉴定了微小小单胞菌（P. micra），一种厌氧的源自口腔的细菌，其在肿瘤组织中显著富集，并与不良预后相关。此外，P. micra的丰度与ESCC肿瘤微环境中调节性T细胞（Treg细胞）浸润增加相关。通过细胞和动物实验，我们证明P. micra通过分泌对甲酚（一种氨基酸发酵的代谢产物）促进肿瘤生长，该代谢物升高活性氧水平并诱导FOXP3+ Treg分化，从而促进免疫抑制和肿瘤生长。我们的研究建立了瘤内微生物群与免疫微环境之间的机制联系，强调了微生物对ESCC进展和预后的贡献。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 瘤内微生物群在食管鳞状细胞癌中的组成和功能影响是什么？特别是微小小单胞菌如何促进肿瘤进展？
- 核心机制
- P. micra分泌的代谢物对甲酚（p-cresol）升高CD4+ T细胞中活性氧（ROS）水平，诱导FOXP3+ Treg分化，形成免疫抑制微环境，从而促进肿瘤生长。
- 主要证据
- 宏基因组测序显示P. micra在肿瘤中富集并与不良预后相关；scRNA-seq和mIF显示其丰度与Treg浸润正相关；皮下瘤模型中P. micra或p-cresol瘤内注射促进肿瘤生长并增加Treg浸润，而NAC可消除这些效应。
- 研究意义
- 本研究揭示了瘤内微生物群与免疫微环境之间的机制联系，强调了微生物对ESCC进展的贡献，并提示靶向微生物代谢物或抗氧化治疗可能具有治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
关键菌种鉴定与预后关联
鉴定肿瘤富集且与预后相关的菌种
通过差异丰度分析和多因素Cox回归，鉴定肿瘤富集且与不良预后相关的菌种，包括P. micra。
P. micra丰度验证与跨队列验证
验证P. micra在肿瘤中的富集及其在其他胃肠道癌症中的普遍性
通过qPCR和FISH验证P. micra在独立样本中的富集；分析公共数据集中P. micra在胃癌和结直肠癌肿瘤中的丰度。
单细胞转录组分析肿瘤免疫微环境
表征ESCC肿瘤微环境中的细胞组成，特别是Treg细胞
对41个肿瘤和4个正常组织进行scRNA-seq，鉴定细胞亚群，并分析P. micra丰度与Treg细胞比例的相关性。
体外实验验证P. micra代谢物对T细胞的影响
探究P. micra是否通过代谢物而非活菌或分泌蛋白影响T细胞功能
用P. micra条件培养基（CM）、热灭活CM、热杀死细菌处理Jurkat细胞和小鼠脾脏CD4+ T细胞，检测Treg相关分子表达。
体内验证P. micra及其代谢物的促肿瘤作用
验证P. micra及其代谢物对肿瘤生长和免疫微环境的影响
在mEC25皮下移植瘤模型中，瘤内注射P. micra、P. micra CM、p-cresol或NAC，测量肿瘤生长并分析免疫细胞浸润。
代谢组学分析肿瘤间质液
鉴定P. micra介导肿瘤促进作用的代谢物
对P. micra处理或PBS处理的皮下瘤模型的肿瘤间质液进行非靶向代谢组学分析，筛选差异代谢物。
机制验证：p-cresol通过ROS诱导Treg分化
验证p-cresol通过ROS途径诱导Treg分化并促进肿瘤生长
用p-cresol和/或ROS清除剂NAC处理Jurkat和CD4+ T细胞，检测ROS水平和Treg分化；在体内验证NAC对p-cresol促肿瘤效应的阻断。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 宏基因组测序 | DNeasy PowerSoil Pro 试剂盒 | Qiagen | -- |
| QIAseq FX DNA文库构建试剂盒 | Qiagen | -- | |
| TURBO 脱氧核糖核酸酶 | Invitrogen | -- | |
| 胶原酶IV | Sigma-Aldrich | -- | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 苯zonase核酸酶 | Merck Millipore | -- | |
| 蛋白酶K | Qiagen | -- | |
| 16S测序 | Qubit荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| VAHTS通用DNA文库制备试剂盒（Illumina V3） | Vazyme | -- | |
| qPCR | Femto细菌DNA定量试剂盒 | Zymo Research | -- |
| SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| 化学发光底物试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Amersham Imager 600成像仪 | -- | -- | |
| RNA提取与qPCR | RNA快速纯化试剂盒 | ES Science | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| CD4+ T细胞分离 | EasySep小鼠CD4+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL | -- |
| CD4+ T细胞培养 | 抗小鼠CD3/CD28磁珠 | Gibco | -- |
| 流式细胞术 | 可固定活性染料780 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| True-Nuclear转录因子缓冲液套装 | BioLegend | -- | |
| 细胞活力测定 | CCK-8试剂盒 | DOJINDO | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA荧光探针 | Beyotime | -- |
| 细菌培养 | 厌氧产气袋 | Mitsubishi Gas Chemica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、年龄、性别；细胞植入量；细菌注射剂量、频率；代谢物浓度 阅读提示：见Materials and Methods中'Mouse models'部分 |
| 细胞培养和处理 | 细胞系、培养基、处理浓度和时间 阅读提示：见Materials and Methods中'Cell culture and treatment'部分 |
| 体外T细胞分化实验 | CD4+ T细胞分离方法、刺激条件、处理物和浓度 阅读提示：见Materials and Methods中'Mouse CD4+ T cell isolation and in vitro assays'部分 |
| 体内代谢物注射 | p-cresol和NAC的注射浓度 阅读提示：见Materials and Methods中'Mouse models'部分 |