Harnessing the gut-immune-joint axis: Oral microalgae-based thermoresponsive microspheres enhance intra-articular therapy for rheumatoid arthritis.
包含体外细胞模型、CIA小鼠模型、FMT实验、16S rDNA测序和代谢组学分析，并进行功能验证和机制验证。
Caco-2肠上皮细胞 RAW 264.7巨噬细胞 IEC-6小肠上皮细胞 CIA小鼠模型 Balb/c裸鼠
CIA小鼠模型采用雄性DBA/1小鼠，6-8周龄，于第0天和第21天分别用含完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂的牛II型胶原免疫 CG@GelMA口服剂量为300 μL，含1.4 × 107 CV细胞/mL和2 mg/mL GPS，每日一次 TAA关节腔注射剂量为5 μL 2 mg/mL，于第30、36、42、48天进行 FMT实验使用200 mg/mL粪便悬浮液，每两天一次，从第25天至第49天 抗生素处理使用链霉素2.5 mg/mL、氨苄青霉素0.3 mg/mL、粘菌素0.3 mg/mL，通过无菌饮用水给予
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建负载小球藻（CV）和人参多糖（GPS）的温敏GelMA微球，并评估其形态、光学性质、电荷、结构、胃肠道响应性和释放行为。
使用微流控系统（ELF-MS-1000）制备CG@GelMA，其中水相包含GelMA、光引发剂LAP、CV和GPS，油相为含Span 80的液体石蜡；在37°C下生成液滴，经UV交联形成微球；使用SEM、光学/荧光显微镜、UV-vis、荧光光谱、Zeta电位、FTIR表征；在模拟胃液（SGF）、模拟肠液（SIF）和模拟结肠液（SCF）中评估溶胀、降解和GPS释放。
评估CG@GelMA对CIA小鼠粪上清（FSN）诱导的肠上皮屏障损伤的保护作用。
使用Caco-2单层和Caco-2/RAW264.7共培养模型；FSN刺激Caco-2细胞和巨噬细胞；预处理CV、GPS、Blank@GelMA或CG@GelMA；检测紧密连接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）表达、TEER、FD4通透性。
评估CG@GelMA在LPS刺激的IEC-6细胞中的抗氧化和抗炎作用。
使用IEC-6细胞，LPS刺激，检测ROS水平（DCFH-DA染色）、细胞活力（Calcein-AM/PI和CCK-8）、促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）mRNA表达；以及CV、GPS、CV+GPS、Blank@GelMA、CG@GelMA的ROS清除能力（超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基）。
评估CG@GelMA在体内的胃肠道转运、滞留和降解特性。
使用Balb/c裸鼠口服CV、FITC或CV/FITC@GelMA，在多个时间点进行活体荧光成像（IVIS Spectrum），离体器官成像，SEM分析肠道内容物，粪便荧光监测。
探讨肠屏障功能障碍与关节炎易感性和进展的关系。
在CIA小鼠中，根据临床评分将小鼠分为敏感型和抗性型；在day 20和day 50测量血清FITC-dextran、zonulin水平，小肠和结肠长度，回肠组织H&E、PAS染色，免疫荧光检测紧密连接蛋白。
评估口服CG@GelMA联合关节腔注射TAA对CIA小鼠的治疗效果。
CIA小鼠随机分为Control、CG@GelMA、TAA、CG@GelMA+TAA组；从day 25开始口服CG@GelMA，day 30开始关节腔注射TAA；监测关节炎评分、后爪照片、步态分析；day 48测量肠通透性；day 50处死，进行关节组织学、Micro-CT、肠道组织学、免疫荧光、RT-qPCR、血清细胞因子和脾脏Treg/Th17流式分析、粪便16S rDNA测序。
验证CG@GelMA的治疗效果是否由肠道菌群介导。
从CG@GelMA处理的小鼠收集粪便进行FMT，移植到CIA小鼠，设FMT组、ABX+FMT组（抗生素处理）和FMT（Inactivated）组（热灭活）；评估关节炎评分、Micro-CT、步态、脾脏免疫、肠道组织学和通透性。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 微球制备 | ELF-MS-1000微流控系统 | Engineering for Life | -- |
| 甲基丙烯酰化明胶 | -- | -- | |
| 光引发剂LAP | -- | -- | |
| 司盘80 | -- | -- | |
| 液体石蜡 | -- | -- | |
| 小球藻 | Guangyu Biological Technology | -- | |
| 人参多糖 | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | -- | |
| 微球表征 | SU-70扫描电子显微镜 | Hitachi | -- |
| UV-2600紫外可见分光光度计 | Shimadzu | -- | |
| RF-6000荧光分光光度计 | Shimadzu | -- | |
| Nano-ZS90 Zeta电位仪 | Malvern Instruments | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | AiTing | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 人胰岛素 | -- | -- | |
| RAW 264.7细胞系 | Procell | -- | |
| Caco-2细胞系 | Pricella | -- | |
| IEC-6细胞系 | ATCC | -- | |
| 体外肠屏障模型 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 肠屏障检测 | Millicell ERS-2电阻仪 | Millipore | -- |
| 荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（4 kDa） | Sigma-Aldrich | -- | |
| SpectraMax iD5酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 免疫荧光 | Claudin-1抗体 | Abnova | -- |
| Occludin抗体 | Abcam | -- | |
| ZO-1抗体 | Abcam | -- | |
| DAPI | Servicebio | -- | |
| 抗氧化实验 | Hoechst 33342 | YEASEN | -- |
| DCFH-DA | YEASEN | -- | |
| 细胞活力 | Calcein-AM/PI | Solarbio | -- |
| CCK-8试剂盒 | YEASEN | -- | |
| 抗氧化实验 | 硝基四氮唑蓝 | -- | -- |
| 水杨酸 | -- | -- | |
| 体内成像 | IVIS Lumina LT Series III成像系统 | PerkinElmer | -- |
| Living Image 4.5软件 | -- | -- | |
| 动物实验 | 完全弗氏佐剂 | -- | -- |
| 不完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 牛II型胶原 | -- | -- | |
| 肠通透性测量 | FITC-葡聚糖 | -- | -- |
| ELISA | 小鼠Zonulin ELISA试剂盒 | UpingBio | -- |
| 组织学 | TRAP染色试剂盒 | Servicebio | -- |
| 番红O/固绿染色试剂盒 | Servicebio | -- | |
| Pannoramic MIDI数字切片扫描系统 | -- | -- | |
| 脱钙剂 | Servicebio | -- | |
| 流式细胞术 | 小鼠调节性T细胞染色试剂盒 | MultiSciences (Lianke) | -- |
| 小鼠Th17染色试剂盒 | MultiSciences (Lianke) | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | ABScript III RT预混液（含gDNA去除剂） | ABclonal | RK20429 |
| 2×通用SYBR Green快速qPCR预混液 | ABclonal | -- | |
| QuantStudio™实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 微生物分析 | Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | -- | -- |
| 动物实验 | 曲安奈德 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 微球制备与表征 | 微流控系统型号、GelMA浓度、CV和GPS用量、紫外交联参数、微球粒径范围、释放实验条件 阅读提示：详见Materials and Methods 2.1节及结果3.1节 |
| 体外细胞实验 | 细胞系来源、培养条件、FSN制备方法、处理浓度和时间、TEER和FD4检测条件 阅读提示：详见Materials and Methods 2.2-2.5节 |
| CIA诱导及治疗实验 | 小鼠品系、年龄、免疫方案、分组、给药剂量和时间点、关节炎评分和步态分析方法、组织学和影像学评估 阅读提示：详见Materials and Methods 2.12和2.13节及结果3.6节 |
| FMT实验 | FMT粪便来源、剂量、频率、抗生素组合及浓度、热灭活条件、评估时间点 阅读提示：详见Materials and Methods 2.17节及结果3.9节 |
| 肠道屏障和免疫分析 | FITC-dextran剂量和测量时间、zonulin检测方法、紧密连接蛋白染色和定量、流式细胞术方案、16S rDNA测序方法和数据分析 阅读提示：详见Materials and Methods 2.8-2.10, 2.14-2.16节及结果3.7-3.8节 |
