临床样本转录组分析及差异基因筛选
鉴定与EMs发展相关的渐进性变化基因和关键信号通路
对EMs患者EC、EU和对照子宫内膜进行RNA-seq，筛选差异表达基因（DEGs），通过层次聚类、KEGG富集分析及qPCR验证关键基因表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Kisspeptins通过CREB5抑制PI3K/AKT信号通路从而抑制子宫内膜异位症中异位子宫内膜细胞的侵袭和血管生成
Kisspeptins inhibit ectopic endometrial cell invasion and angiogenesis by suppressing PI3K/AKT signaling pathway via CREB5 in endometriosis.
实验完整度
高包含临床样本转录组分析、qPCR验证、两种小鼠模型验证及细胞实验（划痕、侵袭、成管）和机制研究（Western blot及siRNA敲低）。
主要模型
Ishikawa细胞系 人脐静脉内皮细胞（HUVEC） 同种异体移植EMs小鼠模型 自体子宫内膜移植EMs小鼠模型
重点核对
EMs患者异位子宫内膜（EC）、原位子宫内膜（EU）及无EMs对照组子宫内膜的RNA-seq样本量（5例EMs，3例对照） KP10和KP234在小鼠模型中的给药剂量（20 µg/只，每72小时腹腔注射）及给药时程 细胞实验中KP10的浓度（0、1、10、100 μmol/L）及处理时间 CREB5敲低实验中siRNA的转染量（150 pmol）及所用对照组siRNA 移植物建模方法（同种异体腹腔注射及自体移植黏附）及模型建立时间（14天或7天）
摘要
子宫内膜异位症（EMs）是一种常见的妇科疾病。根据最广泛认可的经血逆流理论，子宫内膜细胞在异位着床过程中需要完成三个关键步骤：粘附、侵袭和血管生成。尽管kisspeptin在多种肿瘤中发挥抗侵袭和抗血管生成作用，但其通过KISS1受体（KISS1R）对EMs相关侵袭和血管生成的潜在抑制作用尚未明确。本研究旨在通过RNA测序鉴定EMs发病过程中的调控基因，并阐明其潜在分子机制。我们对5例EMs患者的异位子宫内膜（EC）和原位子宫内膜（EU）以及3例无EMs女性的对照子宫内膜进行了比较转录组学分析。然后，我们筛选了在EU组和对照组之间表现出显著差异，且在EC和EU之间差异更为显著的基因，表明存在渐进性变化。此外，我们鉴定了EMs发展过程中前20个渐进变化的基因，包括KISS1R。进一步，KEGG通路分析显示，这些渐进变化的差异表达基因主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路。先前研究表明，PI3K/AKT信号通路可能介导EMs中的细胞侵袭和血管生成。此外，大量证据表明，cAMP反应元件结合蛋白（CREB5），一种转录调节因子，可以调节PI3K/AKT通路。然而，CREB5和PI3K/AKT在EMs中的功能变化机制尚不清楚。我们的研究通过动物实验和细胞实验验证了KISS1/KISS1R在EMs中的功能作用。它可能通过增加CREB5介导的PI3K和AKT磷酸化水平的降低来抑制子宫内膜细胞的侵袭和血管生成。这一机制见解为EMs提供了新的致病解释。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KISS1/KISS1R是否通过调控PI3K/AKT信号通路影响子宫内膜异位症中异位子宫内膜细胞的侵袭和血管生成？
- 核心机制
- KISS1通过上调CREB5表达，降低PI3K和AKT的磷酸化水平，从而抑制PI3K/AKT信号通路，进而抑制细胞侵袭和血管生成。
- 主要证据
- 临床样本RNA-seq显示KISS1R表达渐进性下降，KEGG分析富集于PI3K/AKT通路；在EMs小鼠模型（同种异体和自体移植）中KP10降低病灶数量和面积，细胞实验中KP10抑制Ishikawa迁移和侵袭及HUVEC管形成；Western blot显示KP10降低pPI3K/PI3K和pAKT/AKT比值，CREB5敲低逆转这些效应。
- 研究意义
- 该发现为EMs的发病机制提供了新的解释，并可能为EMs患者提供靶向治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建EMs小鼠模型并检测KISS1/KISS1R表达
在体内验证EMs模型中KISS1/KISS1R的异常表达
采用同种异体移植和自体子宫内膜移植方法构建C57BL/6小鼠EMs模型，通过免疫组化检测EU和EC中KISS1R、KISS1、VEGF和MMP9的表达。
KP10和KP234干预EMs小鼠模型
评估Kisspeptin对EMs发展的影响
在EMs建模后，小鼠接受KP10或KP234（kisspeptin-234）腹腔注射，记录病灶发生率和病灶大小，并通过免疫组化检测VEGF和MMP9表达。
细胞功能实验验证KP10的抑制作用
在体外验证Kisspeptin对细胞侵袭和血管生成的影响
使用Ishikawa细胞进行划痕实验和Transwell侵袭实验，使用HUVEC进行管形成实验，检测不同浓度KP10的处理效果。
机制验证：CREB5和PI3K/AKT通路
验证KISS1是否通过CREB5调控PI3K/AKT信号通路
在动物和细胞实验中，通过免疫组化和Western blot检测CREB5、PPP2R2C、PI3K、pPI3K、AKT、pAKT的表达；并在细胞中敲低CREB5（siRNA），观察KP10效应的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | RNA样本总RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP419 |
| RNA-seq文库构建 | U-mRNAseq文库制备试剂盒 | KAITAI-BIO | AT4221 |
| RNA-seq | Ribo-off rRNA去除试剂盒（细菌） | Vazyme | N407 |
| Illumina NovaSeq测序仪 | -- | -- | |
| qPCR | CFX Connect实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- |
| AceQ qPCR SYBR Green预混液 | Vazyme | -- | |
| 5× FastKing-RT SuperMix逆转录预混液 | -- | -- | |
| 细胞侵袭实验 | Transwell小室 | Corning | 3428 |
| 免疫组化 | 兔两步法检测试剂盒 | 北京中杉金桥生物技术有限公司 | -- |
| 抗KISS1抗体 | Affinity Biosciences | DF7133 | |
| 抗KISS1R抗体 | Abcam | ab100896 | |
| 抗MMP9抗体 | Abcam | ab38898 | |
| 抗VEGFA抗体 | Abcam | ab52917 | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab28364 | |
| 抗CREB5抗体 | Proteintech | 14196-1-AP | |
| 抗PPP2R2C抗体 | Proteintech | 12747-1-AP | |
| 抗PI3K抗体 | Abcam | ab227204 | |
| 抗pPI3K抗体（兔多克隆） | Beyotime | AF5905 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗pAKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| 抗CREB5抗体 | Proteintech | 14196-1-AP | |
| 抗PPP2R2C抗体 | Proteintech | 12747-1-AP | |
| 抗PI3K抗体 | Abcam | ab227204 | |
| 抗pPI3K抗体 | Beyotime | AF5905 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗pAKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4061 | |
| 一抗稀释液 | Beyotime | P0256 | |
| 化学发光试剂 | 4A Biotech | 4AW011 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| Kisspeptin-10 | -- | -- | |
| 动物实验 | Kisspeptin-234 | -- | -- |
| 雌二醇 | -- | -- | |
| 3M Vetbond组织粘合剂 | 3M | -- | |
| 细胞侵袭实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 细胞培养 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 动物实验 | 生理盐水 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 患者和对照的纳入标准（年龄、月经周期、未接受激素治疗时间）、样本类型（EC、EU和对照子宫内膜）、收集方式（腹腔镜卵巢囊肿剥除术和刮宫术） 阅读提示：Methods 2.1 Patients and clinical samples |
| RNA-seq及数据分析 | 样本量（5例EMs，3例对照）、DEG筛选阈值（p < 0.05 且 |log2 fold change| > 2）、比对和差异分析软件（HISAT2, edgeR） 阅读提示：Methods 2.2 RNA-sequencing and data analysis |
| EMs小鼠模型建立 | 小鼠品系、周龄、性别；同种异体模型（雌二醇剂量和给药时间、子宫内膜碎片大小、注射方式、建模时间）；自体模型（子宫片段大小、粘合剂、建模时间） 阅读提示：Methods 2.4 Surgical induction of EMs in C57BL/6 female mice |
| KP10/KP234干预 | KP10和KP234的给药剂量（20 µg/只）、给药途径（腹腔注射）、给药频率（每72小时）以及对照组处理（生理盐水） 阅读提示：Methods 2.4 和 Figure 3 |
| 细胞功能实验 | 细胞系（Ishikawa和HUVEC）、KP10浓度（0, 1, 10, 100 μmol/L）、划痕实验观察时间（24, 48, 72小时）、侵袭实验细胞数量（1×10^5）、Matrigel包被量（40 μL）、管形成实验细胞密度（2-5×10^5） 阅读提示：Methods 2.6-2.9 和 Figure 4 |
| CREB5敲低实验 | siRNA序列来源、转染量（150 pmol）、对照组siRNA、转染试剂（Lipofectamine 2000） 阅读提示：Methods 2.10 Transfection |
| 蛋白表达检测 | 抗体（品牌、货号、稀释比例）、蛋白上样量（50 μg）、内参（GAPDH） 阅读提示：Methods 2.5 Immunohistochemistry and 2.11 Western blot analysis |