网络毒理学预测靶点
预测1,2-DCE及其代谢物的潜在靶点，并识别与坏死性凋亡相关的核心靶点。
使用TargetNet、ChEMBL、SwissTargetPrediction和SEA预测靶点，与OMIM和GeneCards的坏死性凋亡相关基因取交集，构建PPI网络并识别核心靶点。
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AHR-CYP1A1轴扰动与坏死性凋亡在1,2-二氯乙烷肝毒性中的作用：整合网络毒理学与体外验证的阐明
AHR-CYP1A1 Axis Perturbation and Necroptosis in 1,2-Dichloroethane Hepatotoxicity: Elucidation by an Integrated Network Toxicology and In Vitro Validation.
实验完整度
中包含体外细胞实验（活力、ROS、坏死性凋亡标志物）及分子对接和网络分析，但缺乏体内模型、基因干预或直接转录活性验证。
主要模型
THLE-2人正常肝细胞系
重点核对
细胞系：THLE-2人正常肝细胞系，购自Procell 1,2-DCE浓度：800 μg/mL用于机制研究，2000 μg/mL用于时间依赖性实验 暴露时间：早期（1-6小时）观察AHR核转位和CYP1A1诱导，48小时观察坏死性凋亡 对照组：0.02% DMSO（或0.05%）作为溶剂对照
摘要
作为一种典型的卤代烃环境污染物，1,2-二氯乙烷（1,2-DCE）在临床上已证实具有肝毒性，但其机制尚未完全阐明。本研究整合网络毒理学、分子对接和体外实验，探讨1,2-DCE诱导肝损伤中的坏死性凋亡。计算分析预测了芳烃受体（AHR）/细胞色素P450 1A1（CYP1A1）通路的参与，分子对接提示1,2-DCE与AHR之间可能存在结合（-6.5 kcal/mol）。CCK-8实验表明，1,2-DCE以浓度依赖性方式降低THLE-2肝细胞活力。值得注意的是，1,2-DCE在1小时内触发AHR快速核转位，并在转录和蛋白水平（3-6小时）短暂上调CYP1A1。进一步研究发现，24小时时细胞内活性氧（ROS）升高。暴露48小时后，CYP1A1表达显著受抑制，同时伴有坏死性凋亡标志物的激活，包括乳酸脱氢酶（LDH）释放增加、碘化丙啶（PI）染色增强，以及受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）磷酸化水平升高。这些发现揭示了一种双相机制：早期通过AHR-CYP1A1轴的适应性应激反应，随后出现通路功能障碍并过渡到坏死性凋亡，提示AHR可能是干预1,2-DCE诱导肝毒性的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 1,2-二氯乙烷是否通过扰动AHR-CYP1A1轴诱导肝细胞坏死性凋亡，从而介导肝毒性？
- 核心机制
- 1,2-DCE作为AHR的潜在配体，短暂激活AHR-CYP1A1轴，随后该轴功能失活，伴随氧化应激和RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡。
- 主要证据
- 分子对接（-6.5 kcal/mol）和免疫荧光显示AHR核转位，RT-PCR和Western blot显示CYP1A1先升后降，DCFH-DA显示ROS升高，LDH释放、PI染色和p-RIPK3/p-MLKL升高表明坏死性凋亡。
- 研究意义
- 研究提出卤代烃肝毒性中“代谢适应-细胞死亡”转变的新范式，为针对AHR/CYP1A1轴的干预策略提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分子对接验证结合
评估1,2-DCE与AHR之间的直接相互作用。
使用AutoDock Vina将1,2-DCE对接至AHR的PAS-B结构域，计算结合自由能并分析相互作用残基。
细胞活力测定
评估1,2-DCE对肝细胞活力的影响，确定IC50。
使用CCK-8试剂盒检测不同浓度和时间点处理后的细胞活力。
AHR核转位检测
验证1,2-DCE处理后AHR是否发生核转位，表明受体激活。
免疫荧光染色观察AHR定位，定量核质比。
CYP1A1表达动态分析
检测1,2-DCE处理不同时间点CYP1A1在mRNA和蛋白水平的表达变化。
RT-qPCR和Western blot分别检测CYP1A1 mRNA和蛋白水平。
氧化应激检测
检测1,2-DCE处理是否诱导ROS产生。
使用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平。
坏死性凋亡评估
验证长期暴露是否诱导坏死性凋亡。
检测LDH释放、PI染色和RIPK3/MLKL磷酸化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Procell | -- | |
| 二甲基亚砜 | Biosharp | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂盒 | Biosharp | BS350A |
| 氧化应激检测 | DCFH-DA | Cayman Chemical Company | 85155 |
| 坏死性凋亡检测 | LDH释放检测试剂盒（WST-8法） | Beyotime Biotechnology | C0019M |
| PI染色液 | Beyotime Biotechnology | C1352S | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Epizyme Biomedical Technology | PC102 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Epizyme Biomedical Technology | GRF102 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Epizyme Biomedical Technology | ZJ102 |
| Western blot | Western blot快速剥离缓冲液 | Epizyme Biomedical Technology | PS107 |
| 多色预染蛋白Marker | Epizyme Biomedical Technology | WJ103 | |
| MLKL单克隆抗体 | Proteintech | 66675-1-Ig | |
| 磷酸化MLKL (Ser358)重组抗体 | Proteintech | 82090-2-RR | |
| RIPK3单克隆抗体 | Proteintech | 68786-2-Ig | |
| GAPDH重组抗体 | Proteintech | 81640-5-RR | |
| CYP1A1多克隆抗体 | Proteintech | 13241-1-AP | |
| 免疫荧光 | AHR多克隆抗体 | Proteintech | 28727-1-AP |
| Multi-rAb® CoraLite® Plus 488-山羊抗兔重组二抗(H+L) | Proteintech | RGAR002 | |
| Western blot | HRP标记的山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00001-1 | |
| 磷酸化RIP3 (Ser227) (D6W2T)兔单抗 | Cell Signaling Technology | 93654 | |
| RT-qPCR | PrimeScript™ RT试剂盒 | Takara Bio | RR047A |
| SuperStar通用SYBR预混液 | CWBIO | CW3360 | |
| RNA提取 | Super FastPure细胞RNA提取试剂盒 | Vazyme Biotech | RC102 |
| RT-qPCR | NanoDrop分光光度计 | -- | -- |
| QuantStudio™实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | ChemiDoc™成像系统 | Bio-Rad | -- |
| 细胞培养 | THLE-2细胞系 | Procell | CL-0833 |
| 统计分析 | GraphPad Prism | -- | -- |
| 图像分析 | ImageJ | -- | -- |
| 分子对接 | AutoDock Vina | -- | -- |
| 分子操作环境(MOE) | -- | -- | |
| PyMOL | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | THLE-2细胞培养条件：DMEM/F12完全培养基，10% FBS，37°C，5% CO2；1,2-DCE新鲜配制，DMSO终浓度≤0.1% 阅读提示：Methods 2.6节 |
| 细胞活力测定 | CCK-8检测：细胞密度8×10^3/孔，处理浓度梯度，IC50计算模型 阅读提示：Methods 2.7节 |
| AHR核转位 | 1,2-DCE浓度800 μg/mL，处理时间1、6、24小时，一抗稀释1:200，二抗稀释1:200，核质比分析每组30个细胞 阅读提示：Methods 2.11节 |
| CYP1A1表达检测 | 处理浓度800 μg/mL，mRNA检测时间点，蛋白检测时间点，内参基因选择 阅读提示：Methods 2.12和2.13节 |
| 氧化应激检测 | DCFH-DA浓度250 μg/mL，处理浓度400、800、2000 μg/mL，处理24小时 阅读提示：Methods 2.8节 |
| 坏死性凋亡检测 | LDH释放检测处理时间24和48小时；PI染色处理48小时；Western blot检测p-RIPK3和p-MLKL 阅读提示：Methods 2.9、2.10和2.13节 |