评估LSDV感染对IFN-I反应的影响
确定LSDV感染是否抑制宿主IFN-β诱导的ISG表达和JAK-STAT信号传导。
在Holstein牛病变皮肤和MDBK细胞中，检测LSDV感染后ISG15、ISG56等mRNA水平，以及IFN-β诱导的STAT1/2磷酸化。
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牛结节性皮肤病病毒蛋白LSDV122损害IFN-I受体复合物的形成以逃逸宿主先天免疫
Lumpy skin disease virus protein LSDV122 impairs IFN-I receptor complex formation to evade host innate immunity.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HEK293T、MDBK、HeLa）、体内小鼠和牛模型、病毒基因敲除（LSDVΔ122）、机制验证（Co-IP、域映射、流式）等多层级验证。
主要模型
HEK293T细胞 MDBK细胞 HeLa细胞 C57BL/6小鼠模型 Holstein牛模型
重点核对
LSDV122与IFNAR1和IFNAR2相互作用，破坏IFNAR复合物形成 LSDV122抑制IFN-β诱导的ISG转录（如ISG56、RSAD2）和STAT1/STAT2磷酸化 LSDVΔ122在MDBK细胞和小鼠模型中恢复IFN-β信号传导并增强ISG表达 LSDV122的表达在病毒感染早期和晚期均存在，不依赖DNA复制（CHX和Ara-C实验）
摘要
牛结节性皮肤病病毒（LSDV）是一种致病性痘病毒，可在牛中引起全身性疾病。尽管LSDV编码多种预测调节宿主防御的蛋白质，但其免疫逃逸策略的潜在机制在很大程度上仍然是个谜。在这里，我们鉴定了LSDV编码的蛋白LSDV122作为I型干扰素（IFN-I）介导的先天免疫的拮抗剂。LSDV122与IFN-I受体的两个亚基IFNAR1和IFNAR2相互作用，破坏它们的正确组装，并阻止下游激酶JAK1和TYK2的募集，导致IFN-β介导的JAK-STAT信号传导和抗病毒干扰素刺激基因（ISGs）诱导受损。LSDV122基因的缺失（LSDVΔ122）通过在体外和小鼠模型中恢复IFN-β诱导的信号传导，增强了抗病毒反应。我们的研究表明，LSDV122在拮抗IFN-I信号传导中起关键作用，对于有效的病毒免疫逃逸至关重要，为合理设计减毒LSDV疫苗提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LSDV如何通过其编码蛋白逃避宿主I型干扰素介导的先天免疫？
- 核心机制
- LSDV122蛋白通过与IFNAR1和IFNAR2的跨膜和胞内域相互作用，破坏IFNAR受体复合物的形成，阻止JAK1和TYK2的募集，从而抑制IFN-β介导的JAK-STAT信号通路和ISG的诱导。
- 主要证据
- 通过免疫共沉淀和共定位实验证明LSDV122与IFNAR1/2相互作用；域映射确定跨膜域关键；LSDV122缺失病毒（LSDVΔ122）在体外MDBK细胞和体内小鼠模型增强IFN-β诱导的ISG表达和STAT1/2磷酸化。
- 研究意义
- 揭示LSDV免疫逃逸的新机制，为合理设计减毒LSDV疫苗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选和验证LSDV122抑制IFN-β信号
从LSDV编码蛋白中筛选能抑制IFN-β诱导ISG表达的病毒蛋白。
在HEK293T细胞中转染LSDV蛋白表达质粒，检测IFN-β诱导的ISG56转录，选出LSDV122和LSDV135；随后在HEK293T和稳定表达LSDV122的MDBK细胞中验证其抑制多个ISG（IFI44、ISG56、RSAD2、MX2）的诱导。
验证LSDV122与IFNAR1/2的相互作用
确认LSDV122是否与IFN-I受体亚基直接结合。
通过共转染和免疫共沉淀实验检测LSDV122与IFNAR1/2的相互作用；在LSDV感染MDBK细胞中检测内源性相互作用；通过共聚焦显微镜观察共定位。
绘制相互作用结构域
确定LSDV122与IFNAR1/2相互作用所需的关键区域。
构建IFNAR1、IFNAR2和LSDV122的截短突变体，通过Co-IP检测相互作用；在HEK293T细胞中检测突变体对IFN-β诱导ISG表达的影响。
分析LSDV122对IFNAR复合物形成和激酶募集的影响
探究LSDV122是否通过影响受体复合物组装来抑制信号传导。
通过流式细胞术检测LSDV122对IFN-I结合的影响；通过Co-IP检测LSDV122对IFNAR1-IFNAR2、IFNAR1-TYK2、IFNAR2-JAK1相互作用的影响。
构建LSDVΔ122并评估其对IFN-I反应的影响
验证LSDV122缺失是否增强病毒诱导的IFN-I反应。
通过同源重组从LSDV/China/Hainan/2021中敲除LSDV122基因，验证纯度和基因表达；在MDBK细胞中检测复制动力学和IFN-β诱导的ISG转录和STAT1/2磷酸化；在小鼠模型中检测血清ISG15、CXCL10和组织ISG表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胰蛋白酶 | NCM Biotech | C100C1 |
| 胎牛血清 | Cellmax | SA211.02 | |
| 青霉素和链霉素 | Pricella | PB180120 | |
| DMEM培养基 | Gibco | C11965500BT | |
| 嘌呤霉素 | VWR | AMR-J593 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A+G琼脂糖 | Beyotime | P2055 |
| 细胞处理 | 重组人IFN-β | ThermoFisher Scientific | 300-02BC |
| 重组人IFN-γ | ThermoFisher Scientific | 300-02 | |
| RT-qPCR | SYBR Green预混液 | Vazyme | Q312 |
| HiScript II Select RT SuperMix（qPCR） | Vazyme | R323 | |
| 细胞处理 | 抑肽酶 | MCE | HY-P0017 |
| 亮抑酶肽 | MCE | HY-18234A | |
| β-甘油磷酸二钠盐 | MCE | HY-126304 | |
| 病毒基因表达分析 | 阿糖胞苷 | MCE | HY-13605 |
| 细胞处理 | 原钒酸钠 | MCE | HY-D0852 |
| 免疫印迹 | 抗HA小鼠单克隆抗体 | Proteintech | 66006 |
| 抗HA兔单克隆抗体 | Sigma | H6908 | |
| 抗Flag小鼠单克隆抗体 | Sigma | AP0530 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗Flag抗体 | Servicebio | ZB15939 | |
| 免疫球蛋白G | Sigma | I5381和I5006 | |
| 磷酸化JAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3331S | |
| JAK1抗体 | ABclonal | A25841 | |
| 磷酸化TYK2抗体 | Cell Signaling Technology | 9321S | |
| TYK2抗体 | Cell Signaling Technology | 14193S | |
| 磷酸化STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9167S | |
| STAT1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-417 | |
| 磷酸化STAT2抗体 | Cell Signaling Technology | 88410S | |
| STAT2抗体 | Cell Signaling Technology | 72604S | |
| IFNAR1抗体 | ABclonal | A0575 | |
| IFNAR2抗体 | Cell Signaling Technology | 53883s | |
| 流式细胞术 | PE标记抗DYKDDDDK标签抗体 | Biolegend | 637310 |
| 免疫荧光 | 抗小鼠IgG（H+L）F(ab')2片段（Alexa Fluor 594结合物） | Cell Signaling Technology | 8890 |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（H+L） | Invitrogen | A11008 | |
| ELISA | 小鼠ISG15 ELISA试剂盒 | CUSABIO | CSB-EL011843MO |
| 小鼠CXCL10 ELISA试剂盒 | BOSTER | EK0736 | |
| 组织匀浆 | 钢珠 | Qiagen | -- |
| 组织研磨仪 | -- | -- | |
| 显微镜 | 蔡司共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒株 | 使用的细胞系（HEK293T、MDBK、HeLa）、LSDV毒株（LSDV/China/Hainan/2021）及其培养条件（培养基、血清浓度） 阅读提示：见Materials and methods: Reagents, antibodies, cells and viruses |
| IFN-β刺激实验 | IFN-β浓度（100 ng/ml、200 ng/ml等）、处理时间（3、6、10小时等）、细胞转染量（2×10^5、5×10^6等） 阅读提示：见Figure legends: Fig 2, Fig 6等 |
| 病毒基因敲除株生成 | 同源重组方法、筛选过程（PCR和免疫印迹验证）、LSDVΔ122的纯度 阅读提示：见Materials and methods: Generation of LSDVΔ122 |
| 动物实验 | 使用的动物品系（C57BL/6小鼠、Holstein牛）、年龄、性别、病毒剂量（2.6×10^5 pfu/小鼠、2×10^6 pfu/牛）、感染途径 阅读提示：见Materials and methods: Animal experiments |
| 机制验证实验 | 抗体来源和稀释度、IP缓冲液成分（20 mM Tris-HCl pH 7.4、1% NP-40等）、洗膜缓冲液盐浓度（750 mM NaCl） 阅读提示：见Materials and methods: Coimmunoprecipitation and immunoblotting analysis |