circRNA表达谱分析
鉴定TSCC中下调的circRNA候选分子
使用Arraystar circRNA微阵列分析配对肿瘤和癌旁组织及细胞系，通过差异表达筛选和qRT-PCR验证，确定hsa-circ-0001030为显著下调的circRNA。
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环状RNA hsa-circ-0001030通过与PKM2的相互作用抑制舌鳞状细胞癌的增殖和顺铂耐受性
Circular RNA hsa-circ-0001030 suppresses proliferation and cisplatin tolerance in TSCC via interaction with PKM2.
实验完整度
高包含体外功能实验（CCK-8、Transwell、集落形成）、机制研究（RNA pull-down、RIP、Western blot）及体内模型（原位瘤、肺转移、皮下移植瘤）等多个独立证据层级。
主要模型
舌鳞状细胞癌细胞系（Cal27, SCC9, Tca8113） 顺铂耐药细胞亚系（Cal27R, SCC9R, Tca8113R） BALB/c裸鼠异种移植模型（原位舌肿瘤模型、实验性肺转移模型、皮下移植瘤模型） TSCC患者组织样本（88例原发组织，11例顺铂耐药组织）
重点核对
hsa-circ-0001030在TSCC组织中的表达水平：采用circRNA微阵列和qRT-PCR验证 PKM2作为hsa-circ-0001030结合蛋白的验证：使用RNA pull-down和RIP实验 hsa-circ-0001030与PKM2的结合位点：位于第138-169核苷酸区域 PKM2酶活性、葡萄糖摄取和乳酸产生量的变化：通过相应试剂盒检测 体内实验中，hsa-circ-0001030过表达对肿瘤生长和顺铂敏感性的影响：使用皮下移植瘤模型，顺铂剂量为10 mg/kg
摘要
目的：顺铂耐药仍然是舌鳞状细胞癌（TSCC）有效治疗的主要障碍。本研究旨在阐明环状RNA（circRNA）hsa-circ-0001030在调节TSCC中顺铂敏感性和代谢重编程中的作用及机制。方法：采用circRNA测序、定量聚合酶链反应和RNA荧光原位杂交检测TSCC组织和细胞系中hsa-circ-0001030的表达。进行功能获得实验（集落形成、细胞计数试剂盒-8、Transwell实验和异种移植模型）以评估增殖、侵袭和顺铂反应。机制研究包括RNA pull-down、RNA结合蛋白免疫沉淀和蛋白质印迹法，以确定丙酮酸激酶M2（PKM2）为hsa-circ-0001030的结合伙伴，并评估糖酵解活性、葡萄糖摄取和乳酸产生。结果：hsa-circ-0001030在TSCC和顺铂耐药细胞中显著下调。hsa-circ-0001030的过表达抑制了肿瘤生长、迁移和糖酵解通量，同时在体内外增强了顺铂敏感性。机制上，hsa-circ-0001030直接结合PKM2的138-169核苷酸区域，抑制PKM2酶活性，限制四聚体形成并增加酪氨酸105（Tyr105）磷酸化，从而阻断PKM2驱动的糖酵解。临床上，hsa-circ-0001030低表达与TSCC患者晚期肿瘤-淋巴结-转移分期、低分化和不良预后相关。结论：hsa-circ-0001030作为一种肿瘤抑制性circRNA，可能抑制TSCC中PKM2依赖的代谢重编程和顺铂耐药，突显其作为克服化疗耐药的预后生物标志物和治疗靶点的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- hsa-circ-0001030在舌鳞状细胞癌中的表达及其在调节顺铂敏感性和代谢重编程中的作用和机制是什么？
- 核心机制
- hsa-circ-0001030直接结合PKM2，抑制其酶活性，增加Tyr105磷酸化，限制四聚体形成，从而阻断PKM2驱动的糖酵解，进而抑制肿瘤增殖和增强顺铂敏感性。
- 主要证据
- 体外功能实验（CCK-8、Transwell、集落形成）显示过表达hsa-circ-0001030抑制增殖、迁移和侵袭；体内异种移植模型（原位、肺转移、皮下）显示抑制肿瘤生长和增加顺铂敏感性；RNA pull-down和RIP实验证实与PKM2直接结合，并鉴定结合位点为138-169 nt；Western blot显示Tyr105磷酸化增加，PKM2活性降低，葡萄糖摄取和乳酸产生减少。
- 研究意义
- hsa-circ-0001030作为肿瘤抑制性circRNA，可能作为预后生物标志物和治疗靶点，用于克服TSCC中的顺铂耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circRNA特性验证
验证hsa-circ-0001030的环状结构、稳定性和亚细胞定位
通过RNase R处理、放线菌素D处理实验验证环状RNA的稳定性；通过RNA核质分离和RNA FISH确定其定位。
体外功能实验
评估hsa-circ-0001030对细胞增殖、迁移、侵袭和顺铂敏感性的影响
通过慢病毒过表达hsa-circ-0001030，进行MTT、CCK-8、集落形成、Transwell迁移和侵袭实验，并检测顺铂IC50。
机制研究
揭示hsa-circ-0001030与PKM2的相互作用及其对糖酵解的影响
通过RNA pull-down、RIP、分段RNA pull-down鉴定结合区域；检测PKM2活性、四聚体形成、磷酸化水平、葡萄糖摄取和乳酸产生。
体内实验
验证hsa-circ-0001030在体内对肿瘤生长、转移和顺铂敏感性的影响
建立原位舌肿瘤模型、实验性肺转移模型和皮下移植瘤模型，使用稳定过表达hsa-circ-0001030的细胞系，观察肿瘤生长和转移，并评估顺铂联合治疗的效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 顺铂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞转染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 新霉素 | -- | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| circRNA微阵列 | Arraystar人circRNA微阵列芯片 | Arraystar Inc. | -- |
| 测序验证 | Sanger测序 | Sangon Biotech | -- |
| RNA稳定性 | 核糖核酸酶R | GeneSeed Biotech | -- |
| RNA核质分离 | PARIS试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qRT-PCR | Evo M-MLV逆转录试剂盒 | Takara | -- |
| Hieff qRT-PCR SYBR Green预混液 | Takara | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| p-PKM2 (Tyr105)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| p-PKM2 (Ser37)抗体 | Biorbyt | -- | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Abcam | -- | |
| 增强化学发光检测系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 集落形成 | 结晶紫 | Beyotime | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室（8 μm孔径） | Corning | -- |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| TEPP-46 | -- | -- | |
| CCK-8 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | -- |
| RNA pull-down | 生物素标记探针 | RiboBio | -- |
| 链霉亲和素包被的磁珠 | Invitrogen | -- | |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| 抗Ago2抗体 | Abcam | -- | |
| 正常兔IgG | Millipore | -- | |
| 糖酵解检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 乳酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| MTT实验 | MTT溶液 | Solarbio Life Sciences | -- |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| HE染色 | 伊红 | -- | -- |
| RNA FISH | Cy3标记探针 | GenePharma | -- |
| DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | -- | |
| 动物实验 | D-荧光素 | Yeasen | -- |
| IVIS-200成像系统 | -- | -- | |
| 显微镜 | Leica DMi8倒置显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| HE染色 | Leica DM2500光学显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| RNA FISH | Zeiss LSM 880共聚焦荧光显微镜 | Carl Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circRNA表达谱分析 | 微阵列芯片类型、差异表达阈值、验证方法 阅读提示：Methods: Arraystar circRNA microarray analysis and Sanger sequencing validation |
| circRNA稳定性 | RNase R浓度和处理时间、放线菌素D浓度和时间点 阅读提示：Methods: RNase R treatment; Assessment of RNA stability using actinomycin D |
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养条件、顺铂耐药细胞系的建立方法和维持浓度 阅读提示：Methods: Specimens and cell lines |
| 体外功能实验 | 细胞接种密度、顺铂浓度梯度、处理时间、Transwell小室孔径和包被条件 阅读提示：Methods: Plate colony formation assay; Transwell migration and invasion assays; Cell viability assay (CCK-8); MTT cell proliferation assay |
| 机制实验 | RNA pull-down探针序列、RIP抗体、PKM2活性检测试剂盒、葡萄糖和乳酸检测试剂盒 阅读提示：Methods: RNA pull-down assay; RNA-binding protein immunoprecipitation assay; Measurement of PKM2 enzymatic activity, glucose consumption, and lactate production |
| 体内实验 | 动物品系、性别、周龄、细胞接种量、顺铂剂量和给药方案 阅读提示：Methods: In vivo experiments |
| 临床样本分析 | 样本采集地点和时间、RNA FISH评分标准、分组阈值 阅读提示：Methods: Specimens and cell lines; Results: Low hsa-circ-0001030 expression is associated with higher malignancy and poor prognosis in TSCC patients |