R-loop活性与临床特征关联分析
探究R-loop活性在ccRCC中的临床意义。
对TCGA-KIRC样本进行ssGSEA量化R-loop活性，比较不同临床分期和转移状态的差异，并分析与预后的关系。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ACACA调节R-loop稳态以增强ccRCC中的脂质代谢和微环境相互作用
ACACA modulates R-loop homeostasis to enhance lipid metabolism and microenvironmental interactions in ccRCC.
实验完整度
高包含多个独立证据层级：多队列转录组分析、单细胞和空间转录组学、体外细胞功能实验及体内异种移植模型，且明确包含功能验证和机制验证。
主要模型
Caki-1细胞系 OS-RC-2细胞系 Caki-1异种移植瘤模型（裸鼠） TCGA-KIRC队列及外部验证队列
重点核对
ACACA在Caki-1和OS-RC-2中的表达差异 shRNA敲低和过表达质粒转染效率验证（qRT-PCR） R-loop积累（S9.6免疫荧光）和DNA损伤（γH2AX）检测 脂肪酸和甘油三酯水平定量（试剂盒） 线粒体膜电位（JC-1）和ROS水平（DCFH-DA）检测
摘要
R-loop是参与基因组调控和不稳定的动态核酸结构，然而它们对透明细胞肾细胞癌（ccRCC）肿瘤微环境（TME）的贡献仍不清楚。在此，我们整合了公开可用的ccRCC转录组和临床数据集，使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）量化R-loop相关活性，并使用线性机器学习算法开发预后模型。R-loop活性在晚期疾病中升高，并与不良预后相关。在R-loop相关基因中，ACACA因其在多个线性预后模型中的主导贡献及其与代谢重编程的强关联而被优先考虑。单细胞转录组学显示，ACACA在恶性细胞中表达相对较高，这些恶性细胞作为与脂质代谢相关信号传导的通讯枢纽，空间转录组学证实ACACA在恶性区域内优先富集。体外和异种移植实验进一步表明，ACACA促进增殖和迁移并抑制凋亡，同时伴随R-loop积累减少、脂肪酸代谢增强和线粒体功能改善。总之，这些发现将ACACA确定为一种与R-loop相关的代谢驱动因子，将基因组应激与ccRCC中的脂质重编程和TME重塑联系起来，支持其作为预后生物标志物和治疗靶点的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- R-loop动态在ccRCC中是否参与代谢重编程和肿瘤进展，以及关键R-loop相关基因ACACA的作用机制。
- 核心机制
- ACACA通过减少R-loop积累和DNA损伤，增强脂肪酸代谢并改善线粒体功能，从而促进ccRCC细胞增殖、迁移和体内肿瘤生长。
- 主要证据
- 体外实验显示ACACA敲低增加R-loop和γH2AX，过表达则相反；体内异种移植实验证实ACACA敲低抑制肿瘤生长，伴随R-loop和DNA损伤增加、脂质和线粒体功能下降。单细胞和空间转录组学显示ACACA在恶性细胞中高表达并与脂质代谢信号相关。
- 研究意义
- ACACA被确定为与R-loop相关的代谢驱动因子，将基因组应激与脂质重编程和TME重塑联系起来，支持其作为ccRCC预后生物标志物和治疗靶点的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建并验证基于R-loop基因的预后模型
识别关键R-loop相关基因并建立预后模型。
使用44个R-loop相关基因，通过多种线性机器学习算法构建Cox模型，比较性能，确定最优模型并外部验证。
ACACA表达的功能富集和相关性分析
探索ACACA高表达相关的生物学功能。
根据ACACA表达分组进行GSEA，并与CancerSEA功能状态进行相关性分析。
单细胞转录组分析ACACA表达和细胞通讯
确定ACACA在细胞类型中的表达模式及其与脂质代谢信号的关系。
分析GSE159115单细胞数据，进行UMAP可视化、细胞通讯分析（CellChat），并重点分析ANGPTL通路。
空间转录组分析ACACA的空间分布
验证ACACA在组织中的空间表达模式。
分析GSE179572和GSE175540空间转录组数据，比较恶性和非恶性区域的ACACA表达。
体外功能实验验证ACACA对细胞行为的影响
验证ACACA对ccRCC细胞增殖、迁移、凋亡和血管生成的影响。
在Caki-1和OS-RC-2细胞中敲低或过表达ACACA，进行CCK-8、Transwell、流式凋亡、管形成实验。
检测ACACA对R-loop和DNA损伤的影响
探究ACACA是否通过调节R-loop稳态影响基因组稳定性。
使用免疫荧光检测S9.6和γH2AX的表达，比较不同ACACA表达水平下的差异。
检测ACACA对脂质代谢和线粒体功能的影响
验证ACACA在脂质代谢和线粒体功能中的作用。
使用BODIPY染色、脂肪酸和甘油三酯定量试剂盒、JC-1流式、DCFH-DA和MitoTracker染色评估相关指标。
体内异种移植实验验证ACACA的功能
在体内验证ACACA对肿瘤生长和代谢的影响。
将sh-ACACA或sh-NC的Caki-1细胞注射到裸鼠皮下，监测肿瘤生长，并对肿瘤组织进行HE、Ki67 IHC、S9.6和γH2AX IF、脂质和线粒体功能检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞和空间转录组分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| McCoy's 5A培养基 | -- | PM150710 | |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 聚凝胺 | 上海吉凯 | -- | |
| RNA提取和qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| Power SYBR Green预混液 | Yeasen | -- | |
| 细胞增殖、迁移和凋亡 | 细胞计数试剂盒-8 | Yeasen | -- |
| 细胞迁移 | Transwell小室（8 μm） | Corning | -- |
| 细胞凋亡 | Annexin V-FITC/PI试剂盒 | KeyGen Biotech | -- |
| 流式细胞术 | BD FACSCalibur流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| 管形成实验 | Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- |
| SOPTOP CX40显微镜 | SOPTOP | -- | |
| 免疫荧光 | S9.6抗体 | Kerafast | -- |
| γH2AX抗体 | Sigma | -- | |
| 荧光二抗 | Cell Signaling | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| IX35荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| 脂质染色 | BODIPY 493/503 | Invitrogen | -- |
| ProLong Gold抗淬灭剂 | Invitrogen | -- | |
| 脂肪酸和甘油三酯定量 | 脂肪酸定量试剂盒 | BioVision | -- |
| 甘油三酯定量试剂盒 | BioVision | -- | |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | Abcam | -- |
| 线粒体膜电位 | JC-1荧光探针 | Invitrogen | -- |
| 线粒体质量 | MitoTracker探针 | Invitrogen | -- |
| 线粒体成像 | STELLARIS 5共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 体内实验 | D-荧光素 | -- | -- |
| 体内成像 | 活体成像系统 | Xenogen Corp. | -- |
| LivingImage软件 | -- | -- | |
| 组织学分析 | DAB过氧化物酶底物试剂盒 | Maxin | -- |
| 统计学分析 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
| R软件 | -- | -- | |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（Caki-1和OS-RC-2），培养基类型（McCoy's 5A、RPMI-1640），血清浓度（10% FBS），培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Methods: Cell culture and transfection |
| 转染与稳定细胞系构建 | shRNA和过表达质粒序列（表S1），转染试剂（Lipofectamine 3000），病毒包装（HEK293T），感染（polybrene），筛选（puromycin，2周） 阅读提示：Methods: Cell culture and transfection, 表S1 |
| qRT-PCR | 引物序列（表S2），内参（GAPDH），使用2^(-ΔΔCt)法 阅读提示：Methods: RNA isolation and qRT-PCR, 表S2 |
| 细胞增殖、迁移和凋亡检测 | CCK-8细胞数（5×10^3/孔），Transwell细胞数（5×10^4），凋亡试剂盒（Annexin V-FITC/PI） 阅读提示：Methods: Cell proliferation, migration, and apoptosis assays |
| 管形成实验 | Matrigel用量（200 μL/孔），HUVEC细胞，条件培养基处理时间（24h） 阅读提示：Methods: Tube formation assay |
| 免疫荧光检测R-loop和DNA损伤 | 抗体浓度（S9.6和γH2AX均为1:200），细胞密度（50-60%），固定和透化时间 阅读提示：Methods: Immunofluorescence (IF) assays |
| 脂质代谢和线粒体功能检测 | BODIPY染色浓度（1 μg/mL），脂肪酸和甘油三酯定量试剂盒（BioVision），JC-1浓度（5 μM），DCFH-DA浓度（20 μM），MitoTracker染色 阅读提示：Methods: BODIPY staining, Fatty acid and triglyceride levels quantification, ROS assay, Mitochondrial membrane potential assay |
| 体内异种移植模型 | 小鼠品系（6周龄雄性裸鼠），细胞数（6×10^6/只），注射部位（皮下腋下），监测频率（每5天IVIS），D-luciferin剂量（150 mg/kg），处死时间（30天） 阅读提示：Methods: In vivo assays |
| 组织学分析 | Ki67抗体，DAB底物试剂盒（Maxin） 阅读提示：Methods: Histological analysis |