机器人辅助样本前处理平台构建与验证
评估机器人平台处理CF-MS样本的效率和重复性。
使用Opentrons和JAKA机器人自动化样品前处理（酶解、脱盐），与手动处理进行比较，分析蛋白鉴定数和变异系数。
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ProteoAutoNet：结合机器人与机器学习的高通量共洗脱蛋白质分析
ProteoAutoNet: high-throughput co-eluted protein analysis with robotics and machine learning.
实验完整度
高包含机器人平台性能验证（与手动比较）、机器学习模型构建与多数据集验证（内部/外部）、蛋白质组学实验（三种细胞系）、功能富集分析和结构预测（AlphaFold3）等至少两个独立证据层级。
主要模型
Nthy-ori 3-1正常甲状腺细胞系 FTC238肺转移性滤泡状甲状腺癌细胞系 TPC-1乳头状甲状腺癌细胞系 FTC133细胞系（外部验证）
重点核对
样本制备流程：细胞裂解、SEC分离、自动化酶解、脱盐等关键步骤 机器学习模型：数据增强策略、正负样本比例、特征选择、超参数优化 质谱数据采集：DIA模式、LC梯度、QE-HF质谱仪参数 差异表达分析：筛选标准（ΔRT≤38秒、排除分子量小于UniProt注释的蛋白） 外部验证：FTC133细胞系数据
摘要
共分离质谱（CF-MS）能够对内源性蛋白质-蛋白质相互作用进行大规模分析，然而CF-MS数据生成的通量较低，因此预测模型常常受到高质量训练数据稀缺和多样性有限的限制。为解决这一问题，我们提出了ProteoAutoNet，一个集成了计算工作流程的机器人实验平台，用于高通量CF-MS分析。该工作流程将样品处理从蛋白质复合物到肽段的通量提高了约两倍。集成的机器学习模型采用了靶向数据增强来扩展和多样化可靠的蛋白质相互作用数据，从而提高了模型的鲁棒性。当应用于三种甲状腺细胞系时，该模型预测了25,173种共洗脱蛋白，AUROC为0.78。该分析揭示了与正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1相比，肺转移性滤泡状甲状腺癌细胞系FTC238中蛋白酶体和前折叠蛋白复合物显著上调。值得注意的是，我们鉴定出在甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1中TGM2与HK1之间的蛋白相互作用显著上调。ProteoAutoNet为研究蛋白质-蛋白质相互作用和发现相互作用提供了一个改进的框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何提高CF-MS的通量并利用机器学习预测蛋白质相互作用，以揭示甲状腺癌相关的共洗脱蛋白网络？
- 核心机制
- ProteoAutoNet通过机器人平台提高样本处理通量，并利用数据增强的XGBoost模型预测共洗脱蛋白，揭示了FTC238中蛋白酶体和前折叠蛋白复合物的上调以及TPC-1中TGM2-HK1相互作用的潜在机制。
- 主要证据
- 在三种甲状腺细胞系（Nthy-ori 3-1, FTC238, TPC-1）中通过CF-MS（DIA模式）鉴定了25,173种共洗脱蛋白，机器学习模型内部测试AUROC为0.78，外部验证AUROC为0.68，并通过AlphaFold3预测了TGM2-HK1相互作用的结构。
- 研究意义
- 该研究提供了一个可扩展的高通量PPI研究框架，有助于发现疾病相关蛋白复合物和潜在生物标志物及药物靶点，为甲状腺癌的机制研究和治疗策略提供参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
数据库整合与机器学习模型开发
构建并优化预测共洗脱蛋白的机器学习模型。
整合CORUM、hu.MAP、Complex Portal数据库，采用两阶段策略（下采样和数据增强），训练XGBoost模型。
三种甲状腺细胞系的CF-MS分析
获取蛋白质共洗脱图谱，用于预测蛋白质相互作用。
对Nthy-ori 3-1、FTC238、TPC-1细胞系进行裂解、SEC分离、自动化酶解和DIA-MS分析。
预测共洗脱蛋白的验证与性能评估
评估模型的预测性能，并确认预测结果的可靠性。
在内部测试集、外部验证集（FTC133）以及三细胞系共识集上评估模型性能，计算AUROC、AUPRC和精确度。
生物学功能分析与差异表达PPI比较
探索预测的共洗脱蛋白的生物学功能，并鉴定癌症相关的差异表达PPI。
对高置信度相互作用进行KEGG通路富集、网络构建、GO富集，并比较FTC238和TPC-1与Nthy-ori 3-1的差异表达PPI，结合AlphaFold3进行结构验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
结构预测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Procell | PM150140 |
| 胎牛血清 | Hyclone | SV30208.02 | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone | SV30010 | |
| Ham's F-12K培养基 | Procell | PM150910 | |
| 高糖DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 蛋白提取 | 蛋白酶抑制剂 | Roche | 04693116001 |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | 4906837001 | |
| 蛋白浓度测定 | BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| 尺寸排阻色谱 | BioSep SEC-s4000色谱柱 | Phenomenex | -- |
| Ultimate 3000高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质标准品混合物 | Supelco | 69385 | |
| 自动化酶解 | 脱氧胆酸钠 | -- | -- |
| 三(2-羧乙基)膦 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 质谱分析 | Q-Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| DIA-NN 1.8 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 机器人辅助样本前处理 | Opentrons和JAKA机器人的操作流程、处理板数、时间安排 阅读提示：Methods中“Automated desalting and digestion of co-fractionated proteins”部分 |
| 质谱分析 | Q-Exactive HF质谱仪的参数设置（如扫描范围、分辨率、AGC目标、最大注入时间）、LC梯度及流动相组成 阅读提示：Methods中“DIA-MS analysis of the cell lines”部分 |
| 机器学习模型训练 | 数据库版本、正负样本比例、数据增强参数、特征定义、模型超参数 阅读提示：Methods中“Machine learning framework for predicting PPIs”部分 |
| 差异表达分析 | 差异筛选标准（ΔRT≤38秒、分子量排除）、fold change阈值、统计检验方法 阅读提示：Methods中“Differential expression analysis of PPIs”部分 |
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基配方、培养条件 阅读提示：Methods中“Cell culture and harvest”部分 |