细胞培养
获得用于免疫荧光标记的细胞样本
使用M5A培养基、10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素培养U2OS细胞。
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使用结构光照明显微镜结合Arivis 4D分析核纤维层微观结构的协议
Protocol for analyzing the microstructure of nuclear fiber layers by using structured illumination microscopy coupled with Arivis 4D.
实验完整度
中文献提供了详细的细胞培养、免疫荧光标记、SIM成像和Arivis 4D图像处理与定量分析的实验步骤，但缺乏功能验证和机制验证。
主要模型
U2OS细胞
重点核对
细胞密度：60%-70% 固定：4%甲醛，15分钟 透化：0.2% Triton X-100，10分钟 封闭：5%正常驴血清，2小时 一抗孵育：4°C，12-14小时
摘要
本文介绍了一种通过免疫标记核骨架蛋白lamin A，结合结构光照明显微镜（SIM）和Arivis 4D中的创新算法定量评估核纤维层微观结构的协议。我们描述了SIM样品预处理和核内lamin A骨架网络成像的步骤。然后详细介绍了在Arivis 4D软件中创建新算法以定量评估高分辨率图像中核骨架微观参数的步骤。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过SIM结合Arivis 4D定量评估核纤维层微观结构。
- 核心机制
- 文中未明确说明。
- 主要证据
- 基于U2OS细胞免疫标记lamin A，通过SIM成像和Arivis 4D图像处理及脚本分析，获得核骨架网络参数。
- 研究意义
- 该协议有助于提高核纤层相关疾病的诊断效率。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
免疫荧光标记
标记核骨架蛋白lamin A
对细胞进行固定、透化、封闭，然后与一抗和二抗孵育。
SIM成像
获取核内纤维层的高分辨率3D图像
使用Zeiss Elyra 7系统进行SIM成像，设置参数并采集z-stack，然后使用SIM2算法处理。
图像预处理
去除背景噪声和核内干扰信号，增强目标信号
在Arivis 4D软件中通过创建pipeline，使用Object Mask、Enhancement Filter等功能进行处理。
骨架提取与定量分析
提取核纤维层3D网络结构并定量其微观参数
使用Morphology Filter、Blob Finder、Object Math、Segment Feature Filter等功能，以及脚本文件进行分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | U2OS细胞系 | Procell | CL-0236 |
| 免疫荧光标记 | 兔抗lamin A抗体 | Abcam | Ab26300 |
| 山羊抗兔488抗体 | Abcam | Ab175471 | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Gibco | A5669801 |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200056 | |
| M5A培养基 | Gibco | 16600082 | |
| 免疫荧光标记（固定） | 4%甲醛 | Biosharp | BL539A |
| 免疫荧光标记（透化） | Triton X-100 | Beijing Biodee Biotechnology Co. | T8787-100 mL |
| 免疫荧光标记（封闭） | 正常驴血清 | Solarbio | SL-050 |
| 免疫荧光标记（洗涤） | 1X PBS | Solarbio | G4250 |
| 细胞培养 | 共聚焦培养皿 | Biosharp | BS-20-GJM |
| SIM成像 | Elyra 7超分辨率显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | U2OS细胞系，培养条件：M5A培养基、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素 阅读提示：Before you begin - Preparation one |
| 免疫荧光标记 | 固定：4%甲醛，15分钟；透化：0.2% Triton X-100，10分钟；封闭：5%正常驴血清，2小时；一抗浓度（未明确）；二抗浓度（未明确）；孵育时间：一抗4°C 12-14小时，二抗25°C 2小时 阅读提示：Step-by-step method details - Immunofluorescence sample preparation |
| SIM成像 | Zeiss Elyra 7系统，63x油镜，488 nm激光，曝光时间200 ms，激光强度5%，帧大小1280×1280，z-stack间隔0.5 μm，SIM2算法处理 阅读提示：Step-by-step method details - Structured light illumination super-resolution microscopic imaging |
| 图像处理 | Arivis 4D软件，去除杂质、去除核内信号、信号增强（Unsharp Mask，半径为2 μm） 阅读提示：Step-by-step method details - Three-dimensional reconstruction and quantitative analysis |
| 骨架提取与定量分析 | Morphology Filter半径0.1 μm，Morphology Filter 2内半径0.0394 μm外半径394 nm，Blob Finder直径0.282 μm概率阈值3.85%分裂敏感度88.2%，Segment Feature Filter体积基线20 μm³，脚本参数修改（INPUT_CHANNEL=0，TAG_FILAMENT=Merge Filter # 1） 阅读提示：Step-by-step method details - Three-dimensional reconstruction and quantitative analysis |