生物信息学筛选与临床相关性分析
识别COAD中异常表达的潜在癌基因及其预后相关性。
利用GEPIA系统分析COAD差异表达基因和生存相关基因，取交集后确定DEPDC1B为候选基因；通过Kaplan-Meier Plotter分析EBF1表达与预后的关系；利用Starbase和Jaspar预测EBF1与DEPDC1B的调控关系。
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EBF1缺失导致的DEPDC1B转录激活促进结肠腺癌细胞周期进展和上皮-间质转化
Transcription Activation of DEPDC1B Upon EBF1 Loss Contributes to Cell Cycle Progression and Epithelial-Mesenchymal Transition in Colon Adenocarcinoma.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内同系移植瘤模型及机制验证，包括DEPDC1B敲低/过表达、EBF1过表达及回复实验、ChIP、双荧光素酶报告基因、MSP等，验证了EBF1通过结合DEPDC1B启动子抑制其转录。
主要模型
人结肠腺癌细胞系SW480和HCT116 小鼠结肠癌细胞系CT26 人类正常结肠上皮细胞FHC 小鼠同系移植瘤模型
重点核对
稳定的DEPDC1B敲低和EBF1过表达的慢病毒转染及嘌呤霉素筛选 皮下移植CT26细胞（1×10^6）和尾静脉注射CT26细胞（5×10^5）的小鼠模型 EBF1过表达和DEPDC1B过表达或回复实验 5-Azac（10 mM）处理72小时以诱导DNA去甲基化 ChIP-qPCR验证EBF1结合DEPDC1B启动子
摘要
基于生物信息学分析，本研究探讨了含DEP结构域的蛋白1B（DEPDC1B）与早期B细胞因子1（EBF1）之间的相互作用、它们的表达模式及其在结肠腺癌（COAD）进展中的功能。DEPDC1B被确定为在COAD中异常表达的潜在癌基因，并在COAD细胞系中检测到其高表达。在COAD细胞系中沉默DEPDC1B可阻断体外上皮-间质转化（EMT）、播散和扩增。此外，DEPDC1B敲低抑制了小鼠CT26细胞在同系移植瘤模型中的致瘤活性和转移。EBF1在COAD中低表达，被发现可抑制DEPDC1B的转录。EBF1过表达降低了DEPDC1B的表达，从而减弱了癌细胞的恶性特性。然而，其肿瘤抑制作用可被DEPDC1B恢复所抵消。EBF1在COAD细胞系中呈现启动子高甲基化模式，在甲基化抑制剂5-氮杂胞苷处理后其表达得到恢复。总之，本研究强调EBF1的高甲基化导致DEPDC1B转录激活，进而促进COAD中的细胞周期进展、EMT和恶性进展。恢复EBF1水平或抑制DEPDC1B表达可能是COAD治疗的有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究DEPDC1B在结肠腺癌中的表达、功能和上游调控机制，特别是EBF1对其转录的调控作用。
- 核心机制
- COAD细胞中EBF1启动子高甲基化导致EBF1表达下调，EBF1缺失解除对DEPDC1B的转录抑制，DEPDC1B上调促进细胞周期进展、EMT和恶性进展。
- 主要证据
- 体外SW480和HCT116细胞中DEPDC1B敲低抑制细胞周期、EMT、迁移侵袭和增殖，EBF1过表达降低DEPDC1B表达并抑制恶性表型，而DEPDC1B回复可逆转；体内CT26同系移植瘤模型证实DEPDC1B敲低抑制肿瘤生长和转移，EBF1过表达抑制肿瘤生长和转移且可被DEPDC1B回复逆转。
- 研究意义
- 恢复EBF1水平或抑制DEPDC1B表达可能是COAD治疗的有前景的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证DEPDC1B在COAD细胞中的表达
验证DEPDC1B在COAD细胞中是否高表达。
通过qPCR和Western blot检测COAD细胞系（SW480、HCT116）和正常结肠上皮细胞（FHC）中DEPDC1B的mRNA和蛋白水平。
体内外功能验证DEPDC1B敲低影响
验证DEPDC1B敲低对COAD细胞恶性表型的影响。
在SW480和HCT116细胞中通过慢病毒载体敲低DEPDC1B，检测细胞周期、凋亡、增殖、迁移、侵袭和EMT标志物表达；在CT26细胞中敲低DEPDC1B并建立皮下和尾静脉转移小鼠模型，观察肿瘤生长和转移。
验证EBF1对DEPDC1B转录的调控
探究EBF1是否直接结合DEPDC1B启动子并抑制其转录。
通过qPCR和Western blot验证EBF1过表达对DEPDC1B表达的影响；通过ChIP-qPCR检测EBF1与DEPDC1B启动子的结合；通过双荧光素酶报告基因实验检测EBF1对DEPDC1B启动子转录活性的影响。
验证EBF1过表达及DEPDC1B回复对肿瘤细胞恶性表型的影响
验证EBF1过表达抑制肿瘤细胞恶性表型，以及DEPDC1B回复是否逆转其效应。
在SW480和HCT116细胞中过表达EBF1，并同时过表达DEPDC1B，检测细胞周期、凋亡、增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。
验证体内EBF1-DEPDC1B级联对肿瘤生长和转移的影响
验证EBF1过表达和DEPDC1B恢复对小鼠肿瘤生长和转移的影响。
将CT26细胞（单独过表达EBF1或同时过表达DEPDC1B）皮下或尾静脉注入裸鼠，检测肿瘤体积、重量、转移结节数和相关蛋白表达。
探究EBF1启动子甲基化状态
探究EBF1在COAD细胞中低表达是否由启动子高甲基化引起。
利用UALCAN数据库预测EBF1启动子甲基化水平；通过MSP检测FHC、SW480和HCT116细胞中EBF1启动子甲基化；用5-Azac处理细胞后检测EBF1和DEPDC1B表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | ATCC | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | 脂质体2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 转染筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 药物处理 | 5-氮杂胞苷 | MedChemExpress | HY-10586 |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | TianGen Biotech | 4992732 |
| 逆转录 | 逆转录试剂盒 | Takara Holdings | RR047Q |
| qPCR | TB Green染料 | Takara | RR820Q |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| DEPDC1B抗体 | GeneTex | GTX32163 | |
| 细胞周期蛋白D1抗体 | Abcam | ab16663 | |
| 细胞周期蛋白B1抗体 | Abcam | ab181593 | |
| CDK1抗体 | Abcam | ab265590 | |
| EBF1抗体 | Abcam | ab315450 | |
| β-微管蛋白抗体 | Abcam | ab6046 | |
| 二抗 | Novus Biologicals | NB7160 | |
| 增强化学发光试剂盒 | -- | -- | |
| 细胞周期分析 | DNA检测试剂盒 | Solarbio | CA1510 |
| 核糖核酸酶A | -- | -- | |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Elabscience Biotechnology | E-CK-A362 |
| 凋亡检测 | TUNEL检测试剂盒 | Solarbio | T2130 |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Merck KGaA | CLS3460 |
| 基质胶 | -- | -- | |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | N-钙黏蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53488 |
| Snail抗体 | NOVUS | NBP1-80022 | |
| 波形蛋白抗体 | NOVUS | AF2105 | |
| Alexa Fluor 647驴抗鼠二抗 | Abcam | ab150107 | |
| Alexa Fluor 488驴抗兔二抗 | Abcam | ab150073 | |
| Alexa Fluor 405驴抗山羊二抗 | Abcam | ab175665 | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| ChIP-qPCR | Pierce磁珠染色质免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26157 |
| EBF1抗体 | Abcam | ab315450 | |
| 正常兔IgG | Abcam | ab172730 | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 脂质体2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668500 |
| 免疫组化 | N-钙黏蛋白抗体 | NOVUS | NBP2-19457 |
| Snail抗体 | NOVUS | NBP1-80022 | |
| 波形蛋白抗体 | NOVUS | NBP1-31327 | |
| DAB显色液 | Sangon Biotech | C520017 | |
| HE染色 | 伊红 | -- | -- |
| 中性树胶 | -- | -- | |
| 甲基化特异性PCR | DNA提取试剂盒 | Tiangen | DP304 |
| 甲基化亚硫酸氢盐转化试剂盒 | Thermo Fisher | MECOV50 | |
| 统计分析 | Prism 8.0.2软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | 细胞系来源、培养基类型、血清和抗生素浓度、转染方法和剂量、嘌呤霉素筛选浓度和时长。 阅读提示：Materials and Methods中的Cells and Treatment部分。 |
| DEPDC1B功能实验 | 慢病毒shRNA序列、转染效率、细胞周期检测的细胞密度和PI染色步骤、CCK-8实验的细胞数量和孵育时间、Transwell实验中细胞数量和Matrigel浓度。 阅读提示：Figure Legends 2的详细描述以及相关Methods部分。 |
| 体内实验 | 小鼠品系、年龄和体重、皮下注射细胞数量（1×10^6）、尾静脉注射细胞数量（5×10^5）、肿瘤测量频率和时间点、观察时间（24天或12周）。 阅读提示：Materials and Methods中的Isograft Tumor Models部分。 |
| EBF1调控实验 | EBF1过表达质粒、ChIP-qPCR中的抗体和IgG、双荧光素酶报告基因实验中的载体和转染比例。 阅读提示：Materials and Methods中的ChIP-qPCR和Dual-Luciferase Reporter Assay部分。 |
| 甲基化分析 | MSP引物序列、5-Azac浓度和暴露时间、DNA提取和亚硫酸氢盐转化步骤。 阅读提示：Materials and Methods中的Methylation-Specific PCR (MSP) Analysis部分。 |