识别副凋亡相关基因并构建预后模型
确定与乳腺癌总生存期显著相关的副凋亡相关基因，并建立风险评分模型。
使用TCGA-BRCA队列，通过单因素Cox回归筛选出12个与总生存期相关的副凋亡基因，再经LASSO回归和多因素Cox回归确定6个关键基因（PI4KB、HSPB8、USP10、LCK、GPR153、NT5C），构建PRRS。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
副凋亡相关基因调控乳腺癌肿瘤免疫微环境并预测预后
Paraptosis-related genes regulate tumor immune microenvironment and predict prognosis in breast cancer.
实验完整度
中该研究包含生物信息学分析（TCGA、GEO、scRNA-seq）和体外细胞实验（敲低PI4KB后检测增殖、迁移），缺少体内实验及机制验证。
主要模型
MDA-MB-231乳腺癌细胞系 MCF-7乳腺癌细胞系 TCGA-BRCA队列 GEO GSE20711队列
重点核对
构建PRRS的6个基因（PI4KB、HSPB8、USP10、LCK、GPR153、NT5C）及其系数 高低风险分组基于中位风险评分 siRNA敲低PI4KB的转染试剂（Yeasen） CCK-8实验细胞接种密度（2000细胞/孔） Transwell实验细胞浓度（1.2×10^5细胞/mL）
摘要
副凋亡是一种非凋亡形式的程序性细胞死亡，在形态和机制上不同于经典凋亡。它已被涉及肿瘤耐药和免疫微环境重塑，但其在乳腺癌（BC）中的作用仍不清楚。我们根据副凋亡相关基因的表达将患者分为两个亚型。然后，我们系统地分析了与这些亚型相关的预后和肿瘤微环境（TME）。此外，我们开发了一个风险评分，命名为副凋亡相关风险评分（PRRS）。我们全面分析了副凋亡与BC预后、TME、免疫评分和药物敏感性的相关性。然后，我们进行了体外实验以验证PI4KB对BC的作用。PRRS可以有效预测BC的预后和免疫。低PRRS与良好的预后相关，其特征是肿瘤纯度降低和免疫细胞浸润增强。此外，PRRS可以帮助识别适合特定药物治疗的患者。最后，我们发现PI4KB在BC中高表达。敲低PI4KB表达显著抑制BC细胞增殖和迁移。我们的研究为BC亚型分类和预后预测建立了一个稳健的框架，为个性化治疗策略提供了新的指导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 副凋亡相关基因能否预测乳腺癌预后并调控肿瘤免疫微环境？
- 核心机制
- 副凋亡相关基因可能通过调节免疫微环境影响乳腺癌预后；PI4KB通过促进细胞增殖和迁移参与乳腺癌进展。
- 主要证据
- 基于TCGA-BRCA队列构建PRRS，并在GEO队列中验证其预后价值；PRRS低风险组显示更高的免疫评分和免疫细胞浸润；体外实验表明敲低PI4KB显著抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞的增殖和迁移。
- 研究意义
- 副凋亡相关基因在预测生存和指导乳腺癌个体化治疗中具有临床重要性；PI4KB可能成为有前景的预后生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PRRS预后性能
评估PRRS在乳腺癌患者中的预后预测能力。
在TCGA-BRCA训练队列和GEO外部验证队列中，根据中位风险评分将患者分为高低风险组，通过Kaplan-Meier生存曲线和ROC曲线评估模型性能。
差异表达基因及功能富集分析
探究高低风险组间的生物学功能和通路差异。
使用limma包识别高低风险组之间的差异表达基因（DEGs），并通过GO和KEGG富集分析揭示相关生物学过程。
构建副凋亡相关预后列线图
结合临床参数和PRRS构建列线图以估计乳腺癌患者的生存概率。
采用单因素和多因素Cox回归分析临床病理指标与PRRS对预后的影响，构建预后列线图，并用ROC曲线和校准曲线评估模型性能。
评估免疫微环境
比较高低风险组的肿瘤免疫微环境特征。
利用CIBERSORT、ssGSEA、ESTIMATE和TIDE等算法评估免疫细胞浸润、免疫评分和肿瘤纯度。
药物敏感性分析
探究PRRS与不同药物敏感性的关联。
使用oncoPredict包估算化疗药物和靶向药物的IC50值，并比较高低风险组间的差异。
单细胞RNA测序验证
在单细胞水平验证副凋亡相关基因的表达分布。
使用EMTAB8107数据集进行质量控制、UMAP聚类和细胞类型注释，分析六个关键基因在不同细胞类型中的表达。
PI4KB功能验证
验证PI4KB对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。
在MDA-MB-231和MCF-7细胞中通过siRNA敲低PI4KB，通过CCK-8、集落形成、transwell和划痕实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | siRNA转染试剂 | Yeasen | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Biotek | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| 抗PI4KB抗体 | Proteintech | 13247-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| HRP标记二抗 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | Biosharp | -- |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Solarbio | #G1063 |
| Transwell实验 | Transwell小室 | FALCON | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据获取与处理 | TCGA-BRCA队列的样本排除标准（生存时间<30天） 阅读提示：Methods 2.1 Data collection |
| 构建PRRS模型 | 六个基因的LASSO系数（USP10: 0.00585764541858519, NT5C: -0.0187881349300088, HSPB8: 0.00132173365899394, LCK: -0.019757663, PI4KB: 0.00551101330066126, GPR153: -0.0304533563586096） 阅读提示：Results 3.2 Construction and validation of PRRS |
| 细胞培养 | 细胞系（MDA-MB-231, MCF-7）、培养基（RPMI-1640）、FBS浓度（10%）、青霉素-链霉素（1%）、培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Methods 2.9 Cell lines, cell culture, and cell transfection |
| siRNA敲低 | 转染试剂品牌（Yeasen），siRNA序列未提供 阅读提示：Methods 2.9 Cell lines, cell culture, and cell transfection |
| CCK-8实验 | 接种密度（2000细胞/孔），检测时间点（0,24,48,72,96h），CCK-8浓度（10%），孵育时间（2h），检测波长（450nm） 阅读提示：Methods 2.11 Cell viability assay |
| 集落形成实验 | 接种密度（300细胞/孔，6孔板），培养时间（14天），固定液（4%多聚甲醛，15min），染色液（0.1%结晶紫，15min） 阅读提示：Methods 2.12 Colony formation assay |
| Transwell实验 | 细胞浓度（1.2×10^5细胞/mL），上室体积（200μL），下室培养基（600μL），培养时间（24h），固定（4%多聚甲醛，20min），染色（0.1%结晶紫，20min） 阅读提示：Methods 2.13 Transwell assay |
| 划痕实验 | 细胞汇合度（≥90%），划痕工具（200μL移液枪头），成像时间（0h,24h,48h） 阅读提示：Methods 2.14 Wound healing assay |